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1容器/密封系统完好性试验---微生物侵入试验方案---大容量注射剂产品验证编号：起草人：部门审核：QA审核:审核批准人：批准日期：1概述微生物侵入试验是对最终灭菌容器／密封件系统完好性的挑战性试验。在验证试验中，取输液瓶，灌装入培养基，在正常生产线上压塞、压盖灭菌。此后，将容器密封面浸入高浓度运动性菌液中，取出、培养并检查是否有微生物侵入，确认容器密封系统的完好性。此同时，需作阳性对照试验，确认培养基的促菌生长能力。2试验样品的制备2.1在玻瓶输液及软袋输液生产线上，按100ml、250ml二种产品规格，各取300瓶（袋）数量的瓶（袋）中，灌装营养肉汤培养基，使用自动压塞和压盖设备将容器密封。2.2将灌装后的容器经121℃、20分钟灭菌（过度杀灭法灭菌）。2.3从灭菌柜中取出试样，冷却，将每一试样倒转，使培养基与容器内表面充分接触，在30～35℃下竖放培养14天。3确认培养基促菌生长能力——营养性试验3.1所有试样培养14天均不长菌时，随机取20个带盖试样，每个试样内接种1ml的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC9027，菌液浓度：10～2100CFU/1ml。3.2在30～35℃下培养7天，或培养至所有试样都呈阳性结果。3.3若7天内，所有接种铜绿假单胞菌的试样中，微生物生长良好，则容器内培养基的促菌生长能力可判为合格。使用革兰染色和紫外灯下肉汤呈蓝绿色荧光的性质，来鉴定并确认试样容器内生长的菌为接入的铜绿假单胞菌。4挑战菌悬浮液的制备4.1从铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC9027的新鲜斜面上取一整环培养物，分别接入含lOml无菌培养基的试管中，在30～35℃下培养16～18h。4.2将每管的培养物分别转入含1000ml相同培养基的容器内，于30～35℃下培养22～24h。在培养结束时，能明显见容器内培养基出现浑浊。4.3培养结束后的菌悬液即可用来作容器／密封系统完好性试验。5微生物侵入试验操作步骤：本试验须在生物安全柜内或其他不影响生产环境的地方进行。5.1将新鲜的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC9027的菌悬液倒入合适的盆中，用金属丝架固定试样容器，使试倒置在菌悬液中。5.2将50个经最长灭菌程序灭菌的试样倒置，并浸入菌悬液中。试样容器内的无菌培养基应充分接触封口内表面，样品的颈部及封口的外表面应完全浸泡在菌悬液中。5.3实验开始时取一份菌悬液，平板计数每毫升所含的活菌数。按3.3确认试验用微生物是铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。5.4将试样容器在菌悬液中持续浸泡约4h。5.5浸泡结束时，再用平板计数菌悬液的浓度。5.6从菌悬液中取出试样，擦干试样容器外残余的菌悬液，然后用含0.5％过氧乙酸的70％异丙醇消毒容器外表面。5.7取装满培养基的样品两个，作阳性对照。阳性对照用样品制备方法同试样，3但不经菌悬液浸泡，其外表用含0.5％过氧乙酸的70％异丙醇消毒。此后，接种入10～I00CFU铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC9027，按步骤3进行培养基的营养试验。5.8将消毒后的容器，置30～35℃培养7天。5.9挑战试验用菌悬液经灭菌后丢弃。5.10将挑战试验用的试样培养7天，观察检查试样容器内培养基中微生物的生长情况。5.10.1对每一试样进行观察检查，有生长记作+，无生长计作－。5.10.2如果试样容器长菌，按3.3方法确认生长菌是挑战微生物——铜绿假单胞菌。5.10.3如果所有容器都不长菌，则从浸过菌悬液的试样取10个，分别按步骤3进行培养基的营养检查。6结果评价6.1步骤3、步骤5.8、步骤5.11.3中进行的营养试验都合格，试样的挑战试验才有效。6.2在挑战试验开始时，挑战用菌悬液浓度(活菌数)必须达到1×106CFU/ml。6．3挑战试验中试样如有长菌，需记录长菌的试样数。在试样中如出现长菌试验，则需按下述要求作进一步调查。6．3．1仔细去除微生物生长的容器的盖和塞，检查容器封口是否有缺损，造成微生物侵入。6．3．2将观察到试样容器封口的缺陷，采用拍照或及其他适当详细记录。6．4如果任何挑战试验中长菌的容器不是由于容器封口明显的物理性缺损所致，容器／密封系统挑战试验作失败论处。7贮存稳定性7．1将剩余未经过挑战试验的容器放入箱中，保存在室温，黑暗处。7．2在适当的时间间隔(如12个月、24个月)取出一些容器，重复挑战试验。8验证周期4根据验证情况再定，若包装容器供应商变更后应重新验证。9验证小组分工：验证小组组长:过程监督及数据审查：过程操作：检验：10验证方案批准经验证委员会对此验证方案进行综合分析，同意按此方案进行验证。根据验证结果，由验证委员会给予评价。