第五章--减压柱色谱分离技术

第五章减压柱色谱分离技术为加快柱分离的速度和/或增加分离度，通常采用在柱前加压和柱后减压的方法进行柱层析与分离。—柱前加压法通常称为加压柱色谱—柱后减压法通常称为减压柱色谱第一节真空液相色谱技术VacuumLiquidChromatography第二节半干柱液相色谱Semi-DryColumnChromatographySDC第一节真空液相色谱技术VacuumLiquidChromatography真空液相色谱法，简称VLC，也称减压液相色谱法。是近几年来国外实验室迅速发展起来的新技术，它是利用柱后减压使洗脱剂迅速通过固定相从而很好的分离样品的色谱技术。VLC具有快速，简易，高效，价廉等优点，目前已成功的应用于有机制备以及天然产物如萜类，类酯，双萜及多种生物样品的分离。由于经典的柱层析费时费力，需要大量的固定相和洗脱液，工作效率低，为此人们相继建立了离心薄层、VLC、FCC等快速层析分离的方法。其中VLC在天然产物分离中应用最多。该法1969年由澳大利亚CollJ.C提出，1977年首次应用于分离澳洲软珊瑚中2个新的二萜化合物(Cembrenoids).1979年美国Targett.NM将该法命名为Vacuumliquidchromatography(VLC),并且详细报道了实验装置和操作方法。从此以后，VLC便逐渐为广大化学家所接受，并且在实验装置上作了进一步改进。一、VLC特点VLC实质上是柱色谱，它综合了制备薄层（PreparativePTLC）和真空抽滤技术。VLC不同于常压柱层析和快速柱层析Fcc，因为后两者洗脱剂是连续的，在操作中不会间断；而VLC进行溶剂洗脱时，在加洗脱剂后，在柱后减压下全部抽出，每一次洗脱收集一次，抽干后，再更换溶剂，并再进行下一个流分的收集，所以在这一点上VLC与PTLC多次展开极为相似。（展开一次后吹干，再展）。FCC采用柱前加压，而VLC采用柱后加压。VLC可分离样品量达几十克，而FCC只能分离几克。VLC吸附剂经处理后可反复使用。二、实验装置与操作1986年，Coll和Bowden曾介绍过一种十分简单的用于实验室小规模的减压液相色谱法装置（图－a,b）。Pelletier在1986年，介绍可使用于较大规模的分离的装置（图－2）1.固定相；常采用TLC用硅胶、Al2O3,（粒度：10um～40um硅胶60H或60G）聚酰胺等2.装柱：干法装柱法。将吸附剂装入漏斗或短柱中，轻轻拍紧或减压拍打或从顶端挤压，直至吸附剂紧密，最后变得坚硬。吸附剂的高度一般不超过5cm。3，吸附剂用量：（1）对于微量分离，样品＜100mg,可采用直径为0.5～1cm色谱柱或漏斗，吸附剂高度为5cm，一般固定相用量为10～15：1倍，如图4-a,可在小试管中收集流分。（2）对于0.5～1.0g样品，柱中装有2.5×4cm高度的吸附剂较合适。（3）对于1～10g样品的分离，可在柱中装入5×5cm的吸附剂。（4）较大样品分离，最好采用250ml砂芯漏斗中进行。吸附剂的高度为5cm。（如图b）可用三角烧瓶收集之。加大吸附剂与样品比例，可提高分离度。常用比例为30：1～300：1三、上样放掉真空后，常压下加入低极性溶剂于吸附剂表面上，减压使溶剂均匀流过吸附剂。如有空隙，需要重装。使柱子抽干后，重复1～2次，即可准备上样。A．用低极性溶剂或洗脱剂（如石油醚、正己烷）溶解样品。常压下小心加入柱顶端，再加入洗脱剂或溶剂覆盖吸附剂表面，慢慢减压，使样品在柱顶端形成样品层。B．可也采用固体上样法。即先将样品溶于极性溶剂，加入5～10份吸附剂，旋转蒸发至干后，加到吸附剂的表面上，然后进行洗脱。四，VLC流动相选择与柱层析相同，先用TLC来选择条件。VLC更适用于梯度洗脱，可用二元，三元混合溶剂系统。一般先用极性较小溶剂，如石油醚、正己烷、环己烷，然后逐渐加大极性（CH2Cl2、Et2O、AcOEt、CH3OH）极性溶剂的增加开始要缓慢（1%，2%，3%等），然后增加的幅度可逐渐增大（5%10%20%等），通常收集20～25个流分可将所有成分洗脱。五、洗脱与收集用适当溶剂系统洗脱或用梯度洗脱（gradientelution）。在常压下，加入溶剂后，将柱抽干，收集为一个流分。真空度要求20～70mmHg；抽干后再更换溶剂和容器，重复以上操作，并用TLC跟踪每一个流分的分离情况（先摸一摸再行动）。为避免每一流分拆卸漏斗，可采用图B的方法，该抽滤甁底部为磨口，减去负压后，更换接受甁。六、应用实例1.VLC法可用于合成反应混合物的分离．delphinine(翠雀花碱)于220℃，0．1mmHg下发生裂解反应，生成Pyrodelphine(焦翠雀灵)．两者的混台物用甲苯：丙酮＝24：1洗脱，得到896mgPyrodelphinines;甲苯：丙＝19：1洗脱，得到108mgDelphinine．分离全程仅仅花费2小时．2.VLC法用于多种天然化合物的分离（1）曾有人用VLC法对姜中辛辣成分的分离先将冷冻干燥的姜粉用丙酮提取，经过一系列溶剂分配后，得所需部位。选用一内径为3.5cm的100ml的布氏漏斗内装硅胶60（40～63μm,Merck公司）9.5g,高度3cm.300mg姜提取物的溶液与硅胶60混和，蒸发除去溶剂后，均匀分布于硅胶柱床表面上，并在样品表面上覆盖一张与漏斗内径相同的滤纸，缓缓加入25ml的己烷。待溶剂透过柱床后，开始减压抽干柱床，得第一流分。继续用极性增大的溶剂（己烷－乙醚－乙醚－甲醇）洗脱，每份25ml，共得20份洗脱液，利用该法可将姜醇与姜烯酚完全分开。（2）l．0克pH9-12的Acontiumcolumbianum粗提生物碱混合物，使用65gTLC用Al2O360(Merck,Hbasic,TypeE，EM1085)．甲苯：氯仿＝1：4(V／V)洗脱，于28-30号流份中得到talatizamine(3)265mg;氯仿:甲醇＝19：1洗脱，于35-36号流份中分离得到cammaconine(4)247mg。从两个化台物结构来看，只是在C—18位上有细微差别．若采用PTLC法分离，操作极其繁琐、费时，且消耗大量吸附剂与展开剂．两法相比，VLC明显优于PTLC．（3）利用VLC成功分离海洋腔肠动物的正己烷提取物．将在日本冲绳近海采集到的一种软珊瑚腔肠动物Anemoniasulcatas切碎后用丙酮浸出，浸液浓缩后用正己烷提取，得提取物12.5g,溶解于70ml正己烷：乙酸己酯＝8：2的混合溶剂，用滴管将此溶液均匀添加到硅胶表面．抽真空，洗脱溶剂从正已烷开始，直至最后用乙酸乙酯，梯度洗脱，每次收集200mL，共收集2L，耗时2小时．结合TLC和核磁共振谱，非常满意地分离和确定了10余种萜类、脂肪酸及其酯、甾体化台物(见图)．若用常压柱层桥，需要370g硅胶，费时30小时，耗用10L溶剂，才得到同样的效果．七.小结综上所述，与常压柱层析和快速柱层析相比，真空柱层析具有以下特点：a．分离操作时间短，一般仅需数个小时，b．装置简单、易得，装柱方便，且要求不高，c．分离效果好，这主要是由于固定相的细小颗粒(平均10μm)、较大的表面积(500m2/／g)和合理的装柱方法的原因，d．VLC处理量大．分离几十克的样品，仍能以较快的速度完成。在FCC中，由于玻璃分离柱的限制，处理6g以上的样品时就常困难．常压柱层析虽然没有样品量的限制，但是极其耗时，所用的固定相的量亦很大，e.VLC特别适用于频繁的梯度淋洗，并可使固定相抽干，这又是FCC和常压柱层析无法做到的，f．VLC可以作为进行HPLC分离前的较理想的预处理方法．VLC法也有不足．在使用低沸点溶剂(如石油醚)时．要严格控制好真空度，防止大剂量溶剂挥发。第二节半干柱液相色谱Semi-DryColumnChromatographySDC半干柱液相色谱即在柱后减压时将固定相抽之半干的液相色谱。PeterVinezev等1991年报道利用半干柱液相色谱法对Wittig反应中的差向异构体的分离。一、色谱柱的制备应用砂芯漏斗或短层析柱，装入1：1硅胶60（70－230目）与硅胶HF（薄层层析用规格）的混合物。硅胶床的高度5-8cm，再高对分离结果无明显提高。对于较大量样品的分离可用较大的砂心漏斗，同样可以得到较好的分离效果。有关SDC的实际操作数据包括漏斗直径，装入硅胶量，每一洗脱剂量及被分离样品的关系见表：IIIIIIIVV漏斗直径200120906540packing：硅胶6070～230目5002001003010硅胶HF5002001003010每一流分体积1608060308样品量（g）30～5010～301～101～50.1～1二、洗脱与分离：1.首先用洗脱剂流经吸附剂，抽滤至近干，约有1滴/1－2秒洗脱液流下。或用湿润的硅胶装柱，吸滤至干，再加40％体积的滤液到漏斗中，抽至与吸附剂一直的水平面下。2.样品溶解或稀释用洗脱液，加到湿的吸附剂表面上抽至吸附剂表面相平，溶液的厚度不可高于5mm。如果溶液的体积较大，可分次抽真空加入，操作同上。当所有的样品溶液已加入，开始洗脱，按照同样方法。每一份洗脱液加入后通过吸附剂抽至半干1滴/1－2秒。经过SDC分离，下列Wittig反应所得顺式、反式产物可以得到较好的分离。Z顺式E反式Ph3PCH2RBrt-BuOKPhCH3,t-BuOKPh3P-CHRRCHORCH=CHR'+Ph3PO