噬菌体制剂的研究现状及发展前景作者：赵庆友，朱瑞良（山东

噬菌体制剂的研究现状及发展前景作者：赵庆友，朱瑞良*（山东农业大学动物科技学院山东泰安271018）来源：中国兽药杂志2010-7期南宁兽药科技网（南网）nnsykj.com上传2010-9-1摘要：噬菌体制剂是利用噬菌体溶解细胞的特性而用于治疗动物的病原菌的临床感染。早在20世纪初，噬菌体治疗就取得了积极的治疗效果。目前传统抗生素治疗动物细菌感染时易产生耐药性，而噬菌体制剂则表现出许多突出的优越性。本文从噬菌体的生物学特性，噬菌体制剂的作用机制，以及噬菌体制剂的发展状况和应用前景等方面进行了论述。关键词：噬菌体；制剂；应用；现状；前景。RecentAdvancesAndProspectsInBacteriophageTherapyZHAOQing-you,ZHURui-liang*(CollegeofAnimalScience&VeterinaryMedicine,ShandongAgriculturalUniversity,Tai’an,271018)Abstract:Phagetherapyistotreatbacterialclinicalinfectionsofanimalswithbacteriolysis.Inthe1920’s,Phagetherapyhadhadefficiencyinclinicaltreatment.Manycreaturalexperimentsandclinicaltreatmentsindicatethatphagetherapyisapotentialalternativemethodfortreatmentandpreventionofbacteriadisease.Thismethodcomesalong,quiteopportunelytocountertheresistanceproblemoftheantibiotics.Fromthebiologicalcharacteristics,thetherapymechanism,thedevelopmentstatusandtheapplicationprospects,thesystemicdiscussionofbacteriophageinthisreview.Keywords:Bacteriophage;biologicalagents;application;currentsituation;prospects英国细菌学家和内科医生FrederickTwort和法裔加拿大细菌学家FlixD’Herelle分别在1915年和1917年独立发现了噬菌体，不久之后就用来治疗感染性疾病。d`Herelle最早从来自痢疾的临床样本研究中观察到噬菌体滴度的增加正好伴随着病人的康复过程。他将噬菌体称为“外源性免疫因子”[1]。1934年美国科学家报道了利用噬菌体疗法治疗肠球菌感染的成功率可达80%【2】。但随着抗生素的成功推广应用，二次世界大战之后美国和西欧的大多数国家都终止了噬菌体制剂的研制。近年来细菌耐药性问题不断突现，用抗生素治疗细菌感染面临巨大的挑战，一些科学家和临床工作者开始重视噬菌体制剂的研制。1噬菌体的生物学特征噬菌体(Bacteriophage,phage)是以细菌为宿主的一类病毒，所以又称为细菌病毒，它广泛存在于自然界中，在绝大多数原核生物中都发现了相应的噬菌体。据报道(Acker-man,1987)通过电镜观察到的的噬菌体至少已有2850种(株)，其中有2700种(株)是有尾的，大肠杆菌噬菌体发现的最多，大肠杆菌也是研究得最深入的一种宿主。如A类中的T2、T4、T6，B类中的T1、T5、λ，C类中的T3、T7，D类中的ΦX174，E类中的F2、MS2，F类中的Fd、Fl、M13等都属于大肠杆菌的噬菌体【3】。噬菌体分为温和性噬菌体和烈性噬菌体，烈性噬菌体感染细胞后可立即在宿主细胞内开始自身的生命循环，引起细菌细胞的裂解。温和性噬菌体侵入宿主细胞后，其核酸附着并整合到宿主染色体上和宿主核酸同步复制。随宿主菌的增殖而增殖的噬菌体称为前噬菌体。如果宿主菌遇到某种不利环境条件，前噬菌体可能被激活进而裂解宿主细胞。从噬菌体制剂的角度考虑，温和噬菌体的实用价值不高，我们通常提到的噬菌体均为烈性噬菌体。2噬菌体制剂作用机理噬菌体制剂作用于细菌有两种方式：第一种方式为裂解途径，烈性噬菌体(Virulentphage)感染敏感细菌后，可在其细胞内快速增殖并使之裂解。裂解是一个高度调节的程序化过程，其经典模式是孔蛋白—内溶素途径。孔蛋白控制内溶素的含量，而内溶素的多少决定了裂解的时间[4]。噬菌体进入细菌体内后利用细菌体内的酶系统，进行其自身生物物质的合成。然后子噬菌体以裂解方式从细菌体内涌出，造成细菌的死亡。例如T系噬菌体侵入大肠杆菌(B系)的过程约需30min便能引起被侵入菌的裂解[5]。第二种方式是通过噬菌体的分泌物—内溶素而起作用的，内溶素是噬菌体进入宿主菌后利用细菌体内的物质合成的一类酶蛋白。根据宿主菌的不同可分为两类：革兰氏阳性菌内溶素和革兰氏阴性菌内溶素。革兰氏阴性菌有三种不同原型的内溶素T4gpe、λR和T7[6]，这三种内溶素都是可溶性的且小于20Kda的球蛋白；革兰氏阳性菌的内溶素结构复杂且分子量大于或等于30Kda[7]，C末端有一个直接与细胞壁结合的结构域，能够高度特异性的识别细菌细胞壁决定簇。结合区域可以帮助酶在厚厚的细胞壁中保持活性，并且一旦孔蛋白引发了裂解反应，将更加迅速和彻底的破坏细胞壁。这些结合区域的存在以及高度的专一性，使噬菌体可以作为一种新型的抗菌制剂使用。而革兰氏阴性菌的内溶素则缺乏这些区域。通过生物工程技术分离提纯内溶素，用于临床感染治疗。既可以保证治疗的高效性，又具有较高的安全性。例如，噬菌体C1的内溶素粗制品，纳克级就可以在5秒钟内杀死107个肺炎链球菌[8]。同样数量的内溶素可以有效预防和治疗小鼠口腔中的链球菌。如果使用不同的酶不同的方式攻击胞壁质，内溶素对链球菌的致死性表现出协同效应[9]。因此，在生产中我们可以利用各种酶蛋白不同的组合，扩大宿主谱有效治疗生产中存在的多重感染。3噬菌体制剂的应用细菌性感染是感染性疾病中最常见的类型，而抗生素自发明以来，一直被认为是治疗细菌性感染疾病最有力的武器。正因为这样，抗生素滥用的现象非常普遍，导致致病菌耐药性日益加剧。据报道，目前在许多国家25%的肺炎链球菌已经产生耐药性。美国75%的细菌感染会对一种或多种抗生素产生耐药性，日本50%以上的葡萄球菌分离株具有多重耐药性[10]。随着耐药菌的日益增多，抗生素的治疗效果愈发不明显，寻找新的抗菌制剂已经成为刻不容缓的课题。噬菌体作为一种新兴的治疗方法，受到医疗机构的关注。美国医疗机构在1999年的国际噬菌体会议上预测，在未来的3~5年内美国医院将使用噬菌体制剂治疗抗生素无法控制的感染[11]。3.1作为抗生素的替代者随着抗生素的不断应用，细菌的耐药性问题日益突现。现今全球耐药菌株多达上千种，而噬菌体制剂是抗生素很好的替代者。20世纪80年代，Smith研究小组应用噬菌体治疗大肠杆菌引起的小鼠、猪、牛、羊腹泻取得了较好的治疗效果。研究结果显示，当肌肉注射或脑内注射感染大肠杆菌时，单剂量肌肉注射噬菌体的治疗效果优于多剂量四环素、青霉素、氯霉素、甲氧苄啶和磺胺类药物肌肉注射的治疗效果[12]。Watanabe等人以小鼠为实验对象，应用分离到的噬菌体KPP10治疗由绿脓杆菌引起的小鼠肠源性败血病，有效率达66.7%[13]。据在2008年噬菌体大会上公布的数据，在治疗24名由绿脓杆菌引起慢性耳部感染的患者中，实验组有50%的患者症状消失，而对照组只有20%的患者症状消失。从实验组患者耳部分离到的细菌数量减少了80%，而对照组非但没有降低，甚至还有所升高[14]。而在比利时布鲁塞尔，医学伦理委员会也于2007年批准医务工作者用噬菌体治疗由绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌引起的烧伤后感染[15]。Iandyoung等发现从噬菌体中可以提取具有抗菌活性的噬菌体蛋白，这项突破性发现使噬菌体抗菌治疗再次成为研究的重点【16】。Nelson等从Cl链球菌噬菌体中分离出细胞壁水解酶进行了体外实验，发现该水解酶在体外可以溶解A型链球菌，并成功的进行了动物试验，清除了寄生于动物上呼吸道的A型链球菌，且不干扰其它正常菌群，证实了其抗菌效果【17】。3.2用于细菌的检测在世界医药和公共卫生领域，需要建立快速、特异、灵敏的方法来检测病原细菌。基于抗体检测方法灵敏性好，但费时费力[18]。快速PCR方法提高了灵敏度，并且对许多病原细菌都有效，但是成本昂贵，而且操作技术难度大。噬菌体具有严格的宿主特异性，只能裂解某一种细菌，甚至是某一株细菌，利用噬菌体途径的方法，可提供方便，快速、高度特异性的选择，而且成本较低。Gali等报道发现一种高通量的检测噬菌斑的技术，可以鉴定多重耐药性的结核分枝杆菌，总的检测时间只有48小时，其结果与BACTEC460TB敏感性检测方法（susceptibilitytestingmethod）所得到的结果完全一致[19]。Neufeld等利用新型电化学方法快速鉴定和定量分析病原菌。其原理是利用特异性噬菌体裂解宿主菌，释放出该细菌的胞内酶类，然后通过安培计测量来监测，从而确定病原菌[20]。3.3其他应用噬菌体治疗的概念已经延伸到感染性疾病以外的其它领域。如以丝状噬菌体为载体，携带目的基因可以在哺乳动物细胞里表达[21]。丝状噬菌体的遗传灵活性使得很多蛋白可以与衣壳蛋白融合表达，进而噬菌体可以与真核生物细胞的表面受体特异性作用。4噬菌体制剂治疗作用的特点4.1无副作用传统的抗生素在治疗细菌性感染的同时会杀死消化道中的正常有益菌，从而破坏微生态的平衡，导致其他耐受性致病菌的生长，引起腹泻、胃肠感染等副作用，进而可能引起机体的免疫力下降而导致全身性的感染。而噬菌体的治疗具有特异性，只针对致病菌，不会影响到机体内其他的正常菌群。4.2细菌很难产生抗性据报道(Carlton,1999)细菌对噬菌体产生抗性的突变频率为10-7,而对抗生素的抗性突变频率为10-6[22]。而且烈性噬菌体只有在一定宿主体内存活，能产生相应的变异以适应细菌的变异，而传统抗生素不具备这种优势。4.3无残留噬菌体是宿主依赖性的，会随着细菌宿主的消失而死亡，不会残留在动物产品中。5噬菌体制剂发展前景噬菌体自发现之初便用于感染性疾病的治疗。虽然噬菌体制剂早期治疗的效果不理想，但不能因此否认噬菌体在临床应用中的价值。特别是随着生物技术的发展，我们可以在分子水平上改造噬菌体，扩大其宿主谱，增强裂解能力，敲除其毒力基因。噬菌体治疗还有许多潜在的优势。首先，从噬菌体的特性来看，噬菌体可以随宿主菌的增殖而增殖。并在细菌感染的整个过程中发挥作用，而不像抗生素那样随着时间的推移疗效逐渐降低。其次，在解决耐药性问题上，噬菌体具有高度的宿主特异性，可以杀灭特定的菌型，减少耐药性问题的发生。其原因是噬菌体能靶向到达细菌表面受体，从而弱化耐药突变。另外噬菌体可以单独使用，也可以与其它抗生素联合使用，以有效防控疾病。再者，从应用方面来看，噬菌体的副作用很小，对于那些对抗生素敏感的人来说，噬菌体制剂更是一种理想的治疗途径。准确选择相应的噬菌体也可作为预防用制剂，而且噬菌体制剂获取比较方便，价格比较低廉。总之，病原菌广泛出现耐药性，迫切需要一种新型抗菌制剂，而噬菌体正是一种很好的选择。噬菌体制剂的优点在于专一性的裂解特定病原菌，不会破坏机体的正常菌群，维持机体内环境的稳定。但是，我们对噬菌体是如何特异性的与细菌结合，噬菌体能否有效地作用于不断变异的细菌等方面的知识了解的还很少。为了噬菌体制剂治疗的安全性和可控性，我们还需要对噬菌体的生物特性、噬菌体-细菌-宿主之间的相互作用关系，特别是体内的作用系统做更多的研究。参考文献:[1]d`Herelle,F.1926.Thebacteriophageanditsbehavior,117-121.WilliamsandWil