搜索
仪器原理介绍电喷雾电离源（ESI）套管的清洗、维护（如果需要可以演示操作）电喷雾电离源是一种软电离方式，即便是分子量大，稳定性差的化合物，也不会在电离过程中发生分解，它适合于分析极性强的大分子有机化合物，如蛋白质、肽、糖等。（对于非极性、挥发性的待测化合物，则不使用。）电喷雾电离源的最大特点是容易形成多电荷离子。这样，一个分子量为10000Da的分子若带有10个电荷，则其质荷比只有1000Da，进入了一般质谱仪可以分析的范围之内。根据这一特点，目前采用电喷雾电离，可以测量分子量在300000Da以上的蛋白质。（因此由ESI电离源电离的质谱仪在测量的分子量范围上，理论无上限，只需要调节条件，让其带上更多的电荷即可。）电离源几个参数的意义1、毛细管电压（3KV~8KV）控制合适的电压，以便对于待测化合物有更好的电离度并且在这个条件下不会发生电化学反应，从而降低待测物质的信号。在负离子模式下，由于电压过高，电离源尖端会出现紫色的尖端放电现象，做样品测试的时候要尽量避免，防止由于尖端放电，电压过高使样品发生裂解，从而不能得到较高丰度的分子离子峰。同时也会由于电流的产生，损毁离子源内的元件。2、去溶剂温度（溶剂的最低的气化温度到最高的气化温度之间）电离源温度是溶剂气化的重要参数。软件添加附件之后可以将该参数设置到350℃。对于水比较多流动相而言，我们需要调高电离源的去溶剂温度以便水能最大程度液化，因为有时候未气化的水会进入到质谱仪器内部，对一些阀门造成损坏。（当然，对于水而言，由于表面张力比较高，很难形成电喷雾，所以可以在不影响液相分离的情况下，尽量减少水的含量，避免信号的损失。）3、锥孔电压（根据灵敏度和分辨率进行数值优化）锥孔也可以叫采样孔，调节合适的锥孔电压可以增强仪器的灵敏度，但是锥孔电压过高会造成待测化合物的源内裂解。造成非二级质谱造成的碎片峰的产生，不利于谱图的解析。4、去溶剂气去溶剂气流量的选择：经验法选择去溶剂气，一般流动相的流速为0.1mL/min时候，选择100L/h的去溶剂气流量，0.2mL/min时选择200L/h的去溶剂气流量，依次类推。去溶剂气的流量必须稳定，需将液氮分压表的分压控制在0.6左右，否则做出实验的待测化合物的离子计数重现性很差。另外，当去溶剂气流量升到1000L/h的时候，会发现去溶剂温度的反馈值保持在300℃（如果预设为350℃），属于正常现象。总而言之，电离源的最佳使用效果是要保证从电离源外观看来，一定要产生锥形电喷雾。从图谱上看，如果样品量能保证在mg/mL,质谱的响应值能达到103或者104数量级。如果未达到，分析思路：1、离子模式选择是否正确。2、离子源、锥孔是否清洁。3、所设的离子源数值是不是没有得到相应的反馈值。4、待测样品是否适合用这种电离源进行电离。5、仪器的灵敏度是不是不够（在重新进行软件的附件安装之前，应该保存mstune方法参数，以防由于参数设置问题造成灵敏度下降）。四级杆检测器两种工作方式：1.全扫描scan：指定的两个质核比间扫描每个离子的丰度。2.仅检测被选择的一个或多个离子的丰度。飞行时间检测器原理质荷比与时间的平方成正比，只要测定出飞行时间，就可换算成质荷比。在检测时，显然是质荷比小的先到达检测器，质荷比大的后到达。在通常情况下，离子的飞行时间为微秒数量级。飞行时间性能指标：1.分辨率：RP=M/M（M:为测定的质量，M:半峰高的峰宽）线性模式，分辨串较低；反射模式，分辨率可高达15000“延迟引出”（DE）技术或称“脉冲离子引出”（PIE）2.质量范围：目前的商品仪器．—般可测到几十万原子质量单位（u）飞行时间在多肽，蛋白质，糖，核苷酸有广泛的应用，能使有机质谱测试难得到信号的物质得到理想谱图。MCP检测器微通道板与电子倍增器的作用类似，都是离子的物理型放大器。与电子倍增器不同的是，MCP有成像功能；但是在TOFMS应用中仅使用了电子倍增功能。在微通道板的每个通道的内壁上都涂有一种能发射次级电子的半导体材料，当给微通道板加了一定电压后，就会在每个通道中产生一个均匀的电场。这个电场是轴向的。所以能使进入电场的低能电子（光子或电子）与壁碰撞的时候能产生次级电子，并且在轴向电场的作用下次级电子被加速，这样次级电子碰到壁上又会产生更多的新的次级电子。这样。对于一个入射粒子。在板的输出端就会产生很多的电子。实际上我们很容易理解，每个通道就是一个光电倍增管，不过它没有专门的光阴极，而且打拿极是连续分布的，另外入射电子不只限于光子，事实上任何载能电子，只要在通道壁上能打出次级电子，它都能响应，与光电倍增管外电路分压器相比拟，它利用铅玻璃自身的体电阻作为分压电阻，一般极间总电阻为10欧，通道中的电势梯度使次级电子得到加速，获得能量，从而保证在下一次轰击通道时有足够大的二次发射系数。微通道板（MCP）是由内壁镀有半导体层的微管规则排列熔压而形成的二维阵列，可以将微弱电子图像或信号均匀放大到10000倍以上。保持端面的清洁，不能用手触摸。避免碰撞，挤压造成机械破损。避免真空不高的情况下加高压，以免引起通道内孔放电。防止两端面间高压击穿造成绝缘破坏。防止MCP一次性直接暴露在强粒子束中。二级质谱原理在一级的基础上，确定感兴趣的母离子进行碎裂（借助四极杆进行筛选，使用碰撞池进行碰撞碎裂），碎裂机理为碰撞诱导解离。（CID）本实验选择在一级质谱的基础上选择分子量为721的离子进行碰撞，可得到如下的质谱图，见其碎片峰。二级图谱的碰撞电压的选择直接影响图谱的形成，对数据的解析有很大的影响。最佳情况应该保证图谱中存在5%~10%的原母离子和碎片离子，若碰撞电压设置过高，也会对碎片信息的获得造成影响，碎片过碎，碎片难以解析。二级质谱的应用·待测化合物的碎片获得，可以通过二级图谱与已知化合物的二级碎片进行对比，进行待测化合物的确定。·半定量的方法·多肽测序·代谢产物的鉴定······新开机后仪器使用、调谐一：开机1.打开质谱：总按钮，抽真空与控制电压按钮。2.打开质谱液相与电脑的中枢按钮3.打开电脑，MassLynx软件注意：a.如果MassTune界面是灰色的，而且没有时上时下的峰，则说明电脑与仪器连接不良。b.如果电脑与仪器长期连接不良，质谱控制电压按钮一定要处于关闭状态，以免质谱内电压不受控造成质谱烧毁。二：MCP检测器的老化（老化应在真空24小时后完成，观察压力表在10-7兆帕，Vaccum中的表指针应在绿色区域，避免未达到真空度，MCP双板电极之间通电短路。避免MCP一次性暴露在强的粒子流中）1.打开MSTune界面，点开Pressforoperate（变绿）2.将FlightTube电压逐渐升至5630V。（每隔500V一升。）3.Options中点MCPConditioning：Voltage：start（v）0Stop（v）2300Time：start（mins）720Stop（mins）13.开始之后12小时FlightTube中的MCPDetector为2300v5.关闭质谱：将Voltage以200v为间隔降到0v，关闭Pressforoperate（变红）6.MCP电压最高值是工程师调谐的，若实验过程中发现精密度不高，也避免调MCP的电压，以免对MCP造成损耗。三：质谱校正校正溶液的选择注意事项：选择能够产生离子簇的物质，一般校正溶液的选择与平时所测的物质的分子量范围有关。1.校正溶液异丙醇甲酸钠的配制（本实验室常用校正液）基本比例：以10ml异丙醇甲酸钠为例A.9ml超纯水放入容量瓶中，用甲酸标定，即得10%甲酸溶液。C.将体积比为9:1的异丙醇加入到“2”中的容量瓶中标定，即得甲酸钠溶液。注意：有机相，水相分别过膜。2.打开质谱1、Pressforoperate打开，点开两个气阀。2、ES+Source：capillary调成3350v（负离子模式为2600v，毛细管电压可以根据不同化合物的性质做出调节，总体范围在2kv~8kv之间）desolvationtemperature调到300℃(如果安装附件可以到达350℃)3、TimeofFlight：FlightTube以500v为间隔升到5630vMCPDetector以200v为间隔升到2300v。开启质量校正页面后，质量校正前请先确定目前仪器处于未校正的状态，可以将flie文件中的Uncal—NoCalibration。3.连接校正液与质谱，打开校正液流速，待质谱有信号后按”Acquire”收集信号4.一段时间后（3min左右）将质谱方法停止，观察spectrum,确定下分子量，在MSTune中的Calibration中查询标准物的准确分子量注意：由于经常做的是天然产物，其分子量在400-500之间，所以要校正400-500之间的数值。（按m/z的需求对分子量进行选择，若待测化合物的分子量在700左右，则选择700左右的分子量进行校正。）5.计算Leff值，将计算后的Leff值输入到Option里的TDCsetting中，之后再进行3-4操作，直到采集到的分子量与查表得到的分子量小数点后3位一致即可。6.保存：A.到spectrum中找到process—centre—areas—Tof—ok—ok—file—saveB.MSTune中Calibration—FromFiles—找刚存的文件名称—点“history”（acrumass）—点最近那个时间—okRMSresidual图中的点若偏移太大则删去。(校正后保证质量偏差在10个10ppm)C.再回到MSTunecalibration—file—saveas四、仪器灵敏度的调节一般情况下，每一种待测化合物都有最适合自己的电离条件，对于质谱条件的优化选用标准品进行，但是从科研角度而言，这样的工作一般做的比较少的，除非是基于筛查的目的。进过标准品试液之后，通过调节毛细管电压、电离源温度、去溶剂温度、去溶剂气、电离源与锥孔距离的调节可以对仪器灵敏度进行优化。事实上，每一种化合物都有最佳的质谱条件，普适的灵敏度调节可以用接近仪器最常使用的分子量范围的校正液进行。五、仪器的分辨率的调节完成仪器的灵敏的调节之后可以对仪器的分辨率进行调节，本台质谱仪的分辨率为5000左右，相对于单四级杆的200~2000的分辨率而言属于高分辨质谱仪，并且分辨率主要由于飞行时间管提供。但是相对于市场上高达50000分辨率的质谱而言，分辨率就比较低了。单峰法，R=M/半峰宽，调节offset（微调）、毛细管电压、锥孔电压、MCP检测器电压等参数，但是比较繁琐，建议由专业工程师进行调节。并且MCP检测器电压的调节对其使用寿命影响较大，应该在专业工程师的引导下完成。实际样品的上机测试样品前处理1.选用试剂将样品溶解，难溶解的物质可超声处理。浓度不低于1mg/ml。溶液可以在电离源发生气化，被真空系统抽走。所以应该选择挥发性盐溶液作为流动相，另外使用酸碱时，应尽量避免使用三氟乙酸，以防其抑制样品信号。2.溶解后的样品需要过膜处理（但对于在膜上有吸附的化合物，应选用其他方法。）3.若样品经过高速离心，即30000rpm，样品溶液可以不过膜。流动相选择1.直接进样的方式：样品溶剂多选用甲醇，乙腈，异丙醇，乙醇和水等挥发性溶剂，为了使样品在溶液中离子化，通常使用挥发性的酸或碱如乙酸，氨水等调节溶液的pH。一般流动相要与样品溶解的试剂保持一致。2.常用的溶剂和缓冲液a水、乙腈及甲醇LC-MS理想的溶剂b乙酸和甲酸可降低LC流动相的pH值以提高分离度c氢氧化铵/氨溶液可提高LC流动相的pH值d乙酸铵是一种挥发性盐，用于缓冲流动相，并改善色谱分离而不影响MS的性能。最大浓度不超过0.1mol/L。（尽量控制盐溶液浓度，以防盐析出堵塞毛细管）离子模式的选择1.正离子模式适合于碱性样品，可用乙酸（pH＝3-4）或甲酸（pH＝2-3）对样品加以酸化。2.负离子模式适合于酸性样品，可用氨水或三乙胺对样品进行碱化。（10mmol/L~50mmol/L）3.有些酸碱性并不明确的化合物，可优先选用ESI（