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TaKaRaCode：D350AOneStepPrimeScript®miRNAcDNASynthesisKit(PerfectRealTime)（20次量）宝生物工程(大连)有限公司说明书目录内容页码●制品说明1●制品内容1●保存1●需要准备的其他试剂1●试剂盒原理1●特长3●RNA样品制备3●操作注意4●操作方法41．Poly(A)加尾反应和反转录反应42．RealTimePCR反应5◆应用ThermalCyclerDiceRealTimeSystem扩增仪的操作方法5◆应用ABIPRISM7000/7700/7900HT，67300/7500/7500FastReal-TimePCRSystem的操作方法◆应用LightCyclerRealTimePCR扩增仪的操作方法7●实验条件的选择8●实验例9●引物设计说明10●问答11●制品说明本制品中含有合成Poly(A)多聚尾和合成cDNA所需的全部试剂，可以将样品中的miRNA（起始样品可以是TotalRNA、smallRNAfragments等任何包含miRNA的样品）经过一次反应合成为1stStrandcDNA（样品中的mRNA、snoRNA等其它形式的RNA也会同时被反转录成cDNA）。本试剂盒经过特别的优化，将Poly(A)加尾反应和cDNA合成反应同步进行，在1小时内即可完成miRNA1stStrandcDNA合成，且产物无需进行纯化，可直接使用PCR反应试剂SYBRPremixExTaqII（PerfectRealTime）（TaKaRaCode：DRR081）进行RealTimePCR定量检测，从而准确简便地对miRNA（或mRNA、snoRNA等其它RNA分子）进行表达量分析。由于本试剂盒对反应样品进行的Poly(A)加尾以及cDNA合成不具有特异性，所以经过一次反转录得到的产物可以用于多种miRNA以及mRNA、snoRNA等的定量分析。本制品可以从10pg~5μgTotalRNA反转录合成miRNAs、mRNAs和snoRNA等的1stStrandcDNA，再通过RealTimePCR反应，可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对靶基因进行准确定量、检测，重复性好，可信度高。●制品内容（20μl反应×20次）1.2×miRNAReactionBufferMix（forRealTime）*1200μl2.miRNAPrimeScript®RTEnzymeMix40μl3.0.1%BSA40μl4.Uni-miRqPCRPrimer（10μM）200μl5.RNasefreedH2O1ml×26.EasyDilution（forRealTimePCR）*21ml*1含有dNTPMixture、Mg2+和反转录用的UniversalAdaptorPrimer。*2制作标准曲线时梯度稀释DNA或RNA标准品的稀释液。模板DNA或模板RNA如果用水或TE稀释时，由于受Microtube的吸附作用等原因的影响，往往不能准确地进行稀释，导致实验结果精度降低。使用本制品时，即使稀释至低浓度也能够进行准确地稀释，容易在宽广范围内获得准确定量的标准曲线。EASYDilution也可以单独购买（TaKaRaCode：D9160）。EASYDilution请与本公司RealTimePCR试剂组合使用，对于其他公司同类制品的适用性本公司尚未进行确认。●保存：-20℃。●需要准备的其他试剂SYBRPremixExTaqII（PerfectRealTime）（TaKaRaCode：DRR081）●试剂盒原理1.反转录反应试剂盒中的miRNAPrimeScript®RTEnzymeMix中包含Poly(A)Polymerase和反转录酶PrimeScript®RTase，两种酶经过优化达到最佳比例。试剂盒中的2×miRNAReactionBufferMix中包含反应所需的dNTPMixture、Mg2+和反转录用的UniversalAdaptorPrimer等，其组份也是根据miRNAPrimeScript®RTEnzymeMix进行了优化调整，使上述两种酶都可以达到最佳活力。如原理图1所示，与mRNA不同，miRNA不具有Poly(A)结构，但在本试剂盒的反转录反应中，可以同时对样品中的miRNA以及其它smallnoncodingRNA进行Poly(A)加尾反应，然后利用UniversalAdaptorPrimer（含有oligo-dT）将经过Poly(A)加尾的RNA以及mRNA进行反转录反应得到cDNA，并引入了Uni-miRqPCRPrimer的结合位点，利用这一位置可以对样品中任何cDNA进行定量PCR反应。-1-2.定量PCR反应反转录结束后，采用SYBRGreenI嵌合荧光法对合成的cDNA进行定量分析。RealTimePCR扩增反应可以采用如图2显示的SYBRGreenI嵌合荧光法，即在反应体系中加入与双链DNA结合便可发出荧光的荧光染料SYBRGreenI，通过检测PCR反应液中的荧光信号强度，可以对目的基因进行准确定量，同时还可以测定扩增的目的DNA片段的融解温度。客户可以使用试剂盒中提供的Uni-miRqPCRPrimer及自行设计的miRNASpecificForwardPrimer对miRNA进行定量解析，且使用一次合成的cDNA就可以同时对多个miRNA或者snoRNA、mRNA等分子进行检测。图1.miRNA定量原理图图2.嵌合荧光法原理图-2-荧光物质Primer2．引物退火Polymerase3．延伸反应1．热变性●特长1.Poly(A)加尾反应和反转录反应在同一Tube中同时进行，在较短的时间内高效合成miRNARealTimePCR用的cDNA，可以快速、准确地对miRNA进行表达分析，是进行miRNARealTimeRT-PCR反应的最佳试剂。2.使用一次合成的cDNA就可以同时对多个miRNA或者snoRNA、mRNA等分子进行检测。3.制品中附加了标准曲线制作用稀释液EASYDilution（forRealTimePCR），将TotalRNA或cDNA稀释至低浓度也能够进行准确稀释，容易在宽广范围内获得准确定量的标准曲线。●RNA样品制备本制品是将RNA反转录成cDNA的专用试剂。RNA的纯度会影响cDNA的合成量，而制备RNA的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。因此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套；使用RNA操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。【使用器具】尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列（1）或者（2）方法进行处理。（1）干热灭菌（180℃，60min）（2）用0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃下处理12小时。然后在120℃下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。RNA实验用的器具和仪器建议专门使用，不要用于其它实验。【试剂配制】用于RNA实验的试剂，需使用干热灭菌（180℃，60min）或用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装（也可使用RNA实验用的一次性塑料容器），使用的无菌水需用0.1%的DEPC处理后进行高温高压灭菌。RNA实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。【制备方法】使用如RNAisoPlus（TaKaRaCode:D9108）等传统的RNA纯化方法即可获得满足于本试剂盒反应的miRNA（只需少量的miRNA便可进行RT-PCR反应），或者可以使用其它任何可以保障smallRNA在提取过程中不会丢失的方法。为了提高反应的灵敏度，也可以使用其它smallRNA富集、纯化等方法。【TotalRNA中混有基因组DNA的对策】提取的TotalRNA中常常混有基因组DNA，而基因组DNA可以直接作为PCR模板进行扩增，造成解析结果不准确。为了避免这种情况发生，必须使用DNaseI除去基因组DNA。方法如下：使用常规方法提取TotalRNA后，再使用DNaseI分解混入的基因组DNA，最后进行苯酚/氯仿抽提、乙醇沉淀等纯化TotalRNA。◆操作流程①按下列组份配制反应液。试剂使用量TotalRNA20-50μg10×DNaseIBuffer5μlRNaseInhibitor20UDNaseI（RNase-free）2μl（10U）RNaseFreedH2Oupto50μl②37℃反应20min。-3-③使用以下两种方法使DNaseI失活。A．热处理（1）加入2.5μl0.5MEDTA80℃2min。（2）用RNaseFreedH2O定容至100μl。B．苯酚/氯仿抽提（1）用50μlRNaseFreedH2O定容至100μl后加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）混匀。（2）室温，13,500rpm5min离心，取上清。（3）加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1）混匀。（4）室温，13,500rpm5min离心，取上清。④加入10μl3M醋酸钠，250μl冷乙醇，冰上放置10min。⑤4℃，13,500rpm离心15min，弃上清。⑥加入500μl70%冷乙醇洗净，4℃，13,500rpm离心5min，弃上清。⑦沉淀干燥。⑧加入适量RNaseFreedH2O溶解。【基因组DNA确认方法】不进行反转录反应，通过RealTimePCR确认基因组DNA混入量。●操作注意以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前一定认真阅读。1）当同时需要进行多个反转录反应时，应先配制各种试剂的混合液（MasterMix；其中包括RNaseFreedH2O、Buffer、酶等），然后再分装到每个反应管中。这样，可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验样品之间产生的误差。2）miRNAPrimeScript®RTEnzymeMix是酶的混合制剂，使用前要小心地离心收集到反应管底部。由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。3）本制品使用前请于-20℃保存，融解后的制品请于冰上放置，使用后也请立即保存于-20℃。4）反应液的配制、分装请一定使用新的（无污染的）枪头、Microtube等，尽量避免污染。●操作方法1.Poly(A)加尾反应和反转录反应。1）按下列组份配制反应液（反应液配制请在冰上进行）。试剂使用量2×miRNAReactionBufferMix（forRealTime）10μl0.1%BSA2μlmiRNAPrimeScript®RTEnzymeMix2μlTotalRNA（10pg/μl~1μg/μl）*11μlRNaseFreedH2OUpto20μl*1*1反应体系可按需求相应放大，20μl反应体系可最多使用5μg的TotalRNA。2）反应条件如下：37℃60min*2（Poly(A)加尾和反转录反应）85℃5sec（酶的失活反应）*2PCR反应有非特异性扩增时，可将温度升到50℃会有所改善。3）向得到的RT反应液中添加RNaseFreedH2O补足至100μl。取2μl稀释液加入到下一步的RealTimePCR反应体系中，进行定量检测。建议在25μlPCR反应液中使用相当于10pg～100ngTotalRNA量的cDNA为模板。-4-2.RealTimePCR反应。以下是使用本制品进行反转录反应后，选择SYBRPremixExTaqTMII（PerfectRealTime）（TaKaRaCode:DRR081）进行RealTimePCR反应的操作方法。◆应用ThermalCyclerDice®RealTimeSystem扩增仪的操作方法请按照ThermalCyclerDice®RealTimeSystem（TaKaRaCode：TP800）的使用说明书要求进行实验操作。①按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。试剂使用量终浓度SYBR®PremixExTaqT