内生细菌

第四节内生细菌一、概述1．定义内生细菌由克洛珀（Kloepper）第一次提出了“植物内生菌”的概念。早在1926年，Perotti等人在许多健康植物根组织内发现了细菌，被确定为植物体内存在细菌的起始点。植物内生菌（Endophyte）是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌。2．内生菌种类：内生真菌（Endophyticfungi）内生细菌（Endophyticbacteria）内生放线菌（Endophyticactinomyces）等。100多年前人们就已发现在健康植物组织的内部也有微生物存在，这类微生物在文献中后来被称为植物内生菌。自20世纪30年代发现造成畜牧业重大损失的牲畜中毒是由于食用感染内生菌的牧草后，内生菌的研究才得以广泛地开展起来。我国于20世纪70年代陈延熙等相继在棉花、水稻、番茄、辣椒、花生、小麦、烟草、马铃薯、黄瓜等十多种作物中发现内生细菌。近年来，随着研究领域的不断拓宽和研究方法的不断深入，植物内生菌所发挥的重要的生态和生理作用及其作为潜在生防资源和外源基因载体，在农业和医药领域中的巨大应用潜力，已逐渐成为国内外研究的热点。黄瓜内生菌分离菌株对苹果腐烂病菌的抑制效果分离菌株对棉花枯萎病菌的抑制效果小麦内生菌菌株对小麦全蚀病菌的抑制作用菌株的革兰氏染色情况（G-）植物内生细菌普遍存在于高等植物中，木本、草本植物，单子叶植物和双子叶植物内均有内生细菌。已在水稻、小麦、玉米、马铃薯、花生、甜菜、黄瓜、番茄、棉花、三叶草、柠檬、葡萄等30多种植物的不同器官中分离到了个80属的内生细菌。内生细菌以假单胞菌属（Pesudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、肠杆菌属（Enterobacter）和土壤杆菌属（Agrobacterium）为主。马铃薯内生细菌包括假单孢菌属（Pesudomonas），芽孢菌属（Bacillus），黄单孢菌属（Xanthomonas），黄杆菌属（Flavobacterium），棒杆菌属（Corynebacterium），不动杆菌属（Acinetobacter），气杆菌属（Aerobacter），微球菌属（Micrococcus），农杆菌属（Agrobacterium）等。从花生中分离的内生菌有细菌和真菌。内生细菌以巨大芽孢杆菌（B.megaterium）、蜡样芽孢杆菌（B.cereus）和枯草芽孢杆菌（B.subtilis），还有黄单胞菌(Xanthomonasspp.)和欧文氏菌(Erwiniaspp.)。内生真菌以丛梗孢属(Monilia)、链格孢属(Alternaria)和黑乌霉属（Memmoniella）、曲霉菌（Aspergillusflavus）为主，未分离到放线菌。3．作用内生细菌在植物体内具有稳定的生存空间，不易受环境条件的影响，可以在植物体内独立的分裂繁殖和传递，使之成为生物防治中有潜力的微生物农药、增产菌或作为潜在的生防载体菌而加以利用。A.植物保护剂。与根围、叶围细菌相比，内生细菌作为生防制剂具有二者不可替代的优势，如系统分布于植物体内、所处环境比较稳定、营养来源可靠且丰富等，从而更有利于其发挥作用。B.促生作用。同根际促生细菌一样，内生细菌既可以产生促生物质，直接促进植物生长，也可以通过与病原菌竞争空间或产生拮抗物质从而间接起促生作用，因此内生菌完全有可能作为增产菌用于生产实践。C.内生细菌可起固氮作用。D.外源基因载体。植物内生细菌是一种良好的外源基因载体，通过基因工程技术将Bt杀菌或杀虫基因导入内生菌中，构建成抗菌或抗虫的工程菌，用于生物防治。目前将Bt杀虫基因导入一些优良的内生菌，用于害虫的生物防治。内生菌控制植物病害的机理1.产生抗生素类物质内生菌产生的抗生素类物质存在植物体内，在植物体内转运，利于发挥防病作用。根际内生菌产生的抗生素物质包括2,4-二乙酞藤黄酚(PHL)、吩嗪羧酸(PCA)、藤黄绿脓菌(pyoluterin,PLT)、硝吡咯菌素(pyrrolnitrin,PRN)、脓青素(PYO)、HCN和一类丁酰内酯(butyrolactones)。其中，PHL和PCA的研究最为深入，它们对小麦全蚀病菌有较强的抑制作用，对黄瓜枯萎病也有一定的生防作用。香港城市大学Urijmoed教授等从中国南海红树中分离出来的内生真菌能产生灰黄霉素A和多种醌类抗生素，对酵母菌和霉菌等均有抑制作用。2.产生水解酶植物内生真菌和内生细菌另一个重要的生防机制是产生水解酶类，如几丁质酶和葡聚糖酶。这些水解酶与植物抗真菌能力有密切关系，因为真菌细胞壁的主要组成成份是几丁质和葡聚糖。这些水解酶可以降解真菌的细胞壁或其它致病因子如毒素等，达到防病效果。一种用于防治水稻稻瘟病的内生细菌Pseudomonasfluorescens产生的几丁质酶和葡聚糖酶的水平与它的防病效果有密切的关系。某些生防菌的几丁质酶基因己经被克隆，可以将这些基因转化到内生菌中,发挥内生菌的优势，提高防病效果。一种用于防治棉花黄萎病的内生菌，可产生某些蛋白酶降解毒素达到防病的效果。3.产生植物生长调节剂内生菌也可产生植物生长激素类物质，如IAA、吲哚乙腈等。Lu等[72]发现大多数黄花蒿内生真菌在体外培养时能产生对小麦和黄瓜幼苗生长不同程度的抑制或促进作用的代谢产物，对其中一种炭疽菌(Colletotrichumsp.)发酵产物的深入分析表明，该菌能产生植物生长激素IAA。假单胞菌属、肠杆菌属、葡萄球菌属(Staphylococcus)、固氮菌属(Azotobacter)以及固氮螺菌属(Azospirillum)内生细菌的一些菌株也可产生植物生长调节物质如乙烯、生长素、细胞激动素,对宿主植物的生长起促进作用。草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)不仅能产生吲哚乙酸，而且还能产生细胞分裂素。这些物质都能有效地促进植物的生长。从墨西哥分离的18株重氮营养醋杆菌(Acetobacterdizotrophicus)都有产生生长素的能力[74]。表明重氮营养醋杆菌在与植物相互作用过程中不仅能固氮，而且还可以通过生长素的调节作用影响植物的谢促进植物生长[75]。最近的一项研究表明，产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)产生的生长素对水稻植株的生长和发育起着重要的调节作用。4.与病原菌竞争营养物质内生菌可以与病原菌形成营养竞争的对抗关系，使病原菌因得不到正常的营养供给而消亡。某些根际定殖内生细菌能产生噬铁素与病菌竞争铁元素，而植物并不受其影响。荧光假单胞杆菌能产生一种黄绿色噬铁素与病菌竞争铁，导致病菌因得不到铁元素而死亡，但在铁充足的情况下，此种竞争引起的病害下降就不明显[77]。田新莉等[78]证明水稻内生真菌在平板颉抗试验中是通过竞争铁元素来抑制纹枯病菌的生长的。5.促进宿主植物生长或增强抵抗力感染内生菌的植物一般具有比未感染内生菌的植株生长快速的特点。内生菌可增进宿主植物对N、P、K等营养元素的吸收。内生菌帮助植物吸收营养一个最典型的例子是内生固氮菌，1988年从甘蔗的根茎中分离到内生固氮营养醋杆菌,后来在其它作物中如玉米、高粱、水稻等分离到内生固氮菌草螺菌，从巴基斯坦生长在盐碱地的Kallar草中分离到固氮弧菌(Azoarcussp.)。人们在研究这些内生固氮菌时发现有些菌类能提供植物高达80%的氮量[79]。傅正擎等[80]用内生菌及其代谢产物与棉花黄萎病菌共培养的方式，证明内生菌可通过促生长作用来提高棉株的抗逆性。陈世苹等[81]证明，在正常条件下，感染内生真菌的黑麦草体内保护酶系统如POD、SOD的活性明显高于未感染内生真菌的植株，并认为内生真菌很可能增强了植物的SOD活性调节能力，从而对植物的抗旱性产生有益影响。许多研究表明，感染内生菌的植物比未感染内生菌的植物具有更强的抗干旱、盐碱等胁迫的能力。6.诱导植物产生抗性对这个生物防治机制，VanLoon[82]和VanWees等[83]叙述的较为清楚。他们认为根际微生物包括在根内定殖的微生物能诱导植物产生一种抗性，这种抗性不同于传统的系统获得性抗性(systemicacquiredresistance,SAR)，命名为诱导系统抗性(inducedsystemicresistance,ISR)。ISR表型与病菌诱导的SAR相似，都能诱导植物产生对病菌的广谱抗性。但ISR中所包含的抗性机制没有病程相关蛋白(PR)的产生。目前对ISR的抗性机制知道得不如SAR的抗性机制清楚，一般认为ISR的抗性与植保素水平的提高和酚类物质积累有关。ISR和SAR信号传导途径是两种不同的路径。同时内生菌能诱导植物产生一些结构方面的抗性，Benhamou等[84]用内生菌BacilluspumilusstrainSE34预接种基因转化豌豆，然后接种病菌，如果病菌的生长限制在木栓层和外皮层内，在病菌企图侵入部位，通过木质和酚类物质的大量沉积，这些细胞的胞壁得到加厚，有效阻止了病菌的侵入。7.产生生物碱植物内生真菌可以产生多种生物碱，大多生物碱对食草动物和昆虫具有毒性，其中一些对植物病害也有防治作用。Li等[85]从雷公藤(Tripterygiumwilfordii)中分离到一株内生真菌(Cyptosporiopsiscf.quercina)，从其液体发酵产物中分离到一种新酰胺生物碱(cryptocin)，对稻瘟病菌(Pyriculariaoryzae)有抑制作用。Elmi等[86]推测感染了内生真菌的高羊茅植株的抗线虫性与内生真菌产生的生物碱有关。二、生态学1．寄生方式专性内生菌：只能生活在寄主细胞内，而在根际无法分离到。如红苍白草螺菌只能生活在高梁和甘蔗组织内。兼性内生细菌：如假单胞菌属（Pesudomonas）、肠杆菌属（Enterobacter）、沙雷氏军属（Sarratia）、产碱菌属（Alcaligens）、志贺氏菌属（Shigella）、檬细菌属（Citrobacter）以及革兰氏阳性一些属的细菌，他们不仅生活在植物组织内部，而且也常见于土壤。持久性：持久性的植物内生的细菌可以永久存在于植物组织内部，也可以在整个生育期只存在一段时间。甜菜中的腐烂棒杆菌，存在于整个生活史中。非持久性：非持久性的细菌只存在于整个生活史中的部分生长时期的植物体内。大部分植物内生细菌属于这一类型。专一性：专一性的植物内生细菌它只专一存在于一种植物体内，如重氮营养醋杆菌（Acetobacter），它只存在于甘蔗中。非专一性：非专一性的植物内生细菌，如荧光假单胞可以存在于菜豆、小麦、番茄、柠檬、甜菜和玉米等植物体内，均已经分离出来。2.入侵途径植物内生细菌来源于根际，并从根进入植物组织内部。内生细菌进入植物的途径是通过自然孔口和伤口进入植物的。自然孔口有皮孔、水孔、芽眼、侧根发生处等。把组织培养的马铃薯无菌苗移栽到田间，从中分离出大量与土壤中细菌种类相同的内生细菌。利用抗菌素标记的荧光假单孢菌IS-1的菌悬液浸根，然后移栽，八周后，取根，进行表面消毒，结果重新分离到了IS-1。这不仅说明了内生细菌来源于根际土壤，而且说明了一些细菌既能存在于根际中，又能进入植株体内。植物内生细菌可以通过趋化性或趋电性寻找寄主植物。3．存在部位内生细菌进入植物后，多数定殖于薄壁组织的细胞间隙，有些定殖于细胞质中，有些可穿过细胞壁进入细胞内。有些定殖于维管束内。块薯中菌量大，种类多；块茎和地上茎次之；种子中最少。块茎的皮层，维管束，内韧皮部和中央髓部四个部位中，内生细菌在维管束环的出现频率最高。玉米和杂草的的皮层、外皮层和内皮层，以及植株木质部中都含有大量的内生细菌。内生细菌具有寄主专化性，且在寄主不同器官、生育期和寄主所处的环境中，其种群数量的消长动态各有不同。内生细菌与植物在长期的共同进化中，已成为植物微生态系统的天然组成成份，它促进植物对恶劣环境的适应，加强系统的生态平衡。植物内生细菌可以促进植物修复作用（phytoremediation），针对硝基芳香族、