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lncRNA芯片分析lncRNA芯片分析修改时间2010/6/1613:57:12点击3210次1.归一化lncRNA芯片采用的归一化的方法为quantilenormalization。2.差异LncRNA的筛选lncRNA芯片中既有lncRNA的探针又有mRNA的探针，分别做差异基因的筛选，筛选方法同表达谱的筛选方法是一致的，参见表达谱的差异基因筛选。3.差异lncRNA的重注释lncRNA芯片注释不完善，因此需要将筛选出来的lncRNA进行重注释。将差异lncRNA在基因组上位置上下游延伸，以寻找lncRNA附近的有功能的基因。差异lncRNA重注释示例4.差异lncRNA靶基因的预测lncRNA可能通过调控相应的mRNA发挥功能，因此有必要预测lncRNA的靶基因。我们提取差异lncRNA和mRNA的序列，首先用blast进行初筛，之后用RNAplex进行进一步筛选，以预测lncRNA可能调控的mRNA。差异lncRNA靶基因预测结果示例5.差异lncRNA与靶基因共表达网络预测出lncRNA的靶基因后，并可进一步在mRNA的数据中探寻该mRNA是否发生表达量的变化。由此构建差异lncRNA与靶基因相互作用网络图。差异lncRNA与靶基因相互作用网络图。方框代表lncRNA，圆形代表mRNA。连线表示可能的调控关系。节点面积越大，表示调控的mRNA越多，预示该lncRNA在调控网络中所起的作用可能越大。6.差异lncRNA与差异mRNA的共表达分析SBCHumanlncRNA芯片能同时检测出差异表达的lncRNA和mRNA。我们将差异lncRNA和差异mRNA在一组样品中进行共表达分析，可以发现与某个lncRNA具有相同表达模式的mRNA。要求：每组数据3个或3个以上生物学重复实验组：对照组：lncRNA与mRNA共表达分析作用图，圆形带圈代表lncRNA，圆形代表mRNA。红色为上调基因，绿色为下调基因。7.差异lncRNA靶基因的GOanalysis对lncRNA的靶基因进行GOOntology的生物学的分类，根据Fisher'sExactTest,得到p-value，得到lncRNA靶基因对应的显著性功能，从而了解lncRNA的功能。8.差异lncRNA靶基因的pathwayanalysis对lncRNA靶基因按照Pathway的主要公共数据库KEGG和Biocarta来进行分类，对Pathway中的基因进行基于离散分布的显著性分析，得到与实验目的有显著联系的Pathway分类,由这些pathway对应相应的靶基因，从而获得该分类即导致lncRNA差异的最重要Pathway。9.差异lncRNA的转录因子的预测提取lncRNATSS的上游2000bp，下游500bp,利用HMM的算法根据TRANSFAC8.1数据库预测其转录因子。1)芯片数据预处理：对实验数据质量评估，预处理及均一化处理。2)差异表达lncRNA及mRNA的筛选：根据客户提供样本量的大小与分布或实验目的，应用倍数法、多重假设检验等手段，对两条件或多条件下的表达差异的lncRNA和mRNA分别进行计算和筛选。※表达模式聚类分析：针对芯片结果进行样本及差异表达lncRNA和mRNA的聚类，寻找属于同一表达趋势的基因或样本。※GO和pathway显著性富集分析：差异基因，应用数据库进行功能富集分析，挖掘具有统计学意义的差异表达基因的功能类别。显著性P值越小，则它随机聚集差异表达基因的概率越小，其功能相关性的非随机性就越小，该功能模块有较大的可能与疾病（或药物作用）相关。※蛋白互作网络分析：研究与指定蛋白质相互作用的其他蛋白质的信息，以使研究人员能够更加深入地认清相关蛋白质的功能，更清楚地理解其调控机制。3)lncRNA-mRNA共表达分析：对于每一个差异表达的lncRNAs，计算得到与之共表达的编码基因。4)lncRNA表达模式分析：考察差异表达LncRNAs的表达模式，将LncRNAs以及与该LncRNAs显著共表达的编码基因的表达模式绘制heatmap。5)lncRNA功能预测：筛选出表达显著相关的lncRNA-mRNA关系对，利用成熟的mRNA的功能来推导lncRNA的功能，对异常表达lncRNA显著相关的mRNA进行功能富集分析。6)lncRNAcis作用机制研究：对于感兴趣的差异表达lncRNAs，搜索其上下游100K范围内的所有编码基因，并与该lncRNAs有显著共表达的基因取交集。这些在基因组上临近、且表达模式上共表达的基因很可能被该lncRNAs所调控。7)lncRNAtrans作用机制研究：计算LncRNAs共表达的编码基因，集合与转录因子/染色质调控复合物的靶基因集合的交集，利用超几何分布计算该交集的富集程度，得到与lncRNAs显著相关的转录因子，从而识别可能与lncRNAs联合发挥调控作用的转录因子/染色质调控因子。※lncRNA--转录因子二元关系及网络分析※lncRNA--转录因子--靶基因三元关系及网络分析[综述]长链非编码RNA（lncRNA）来源:新药筛选中心/点击:1464lncRNA长链非编码RNA（longnoncodingRNA，lncRNA）是一类不编码蛋白的RNA分子，长度在200bp以上，起初被认为是RNA聚合酶II转录的副产物，不具有生物学功能；近期的研究表明lncRNA具有保守的二级结构，可以与蛋白、DNA和RNA相互作用，参与多种生物学过程的调控，尤其在肿瘤当中发挥了重要的调控角色，如染色质修饰、转录激活和抑制、转录后调解以及作为miRNA的诱导分子干扰基因的表达等。随着高通量测序技术的发展，越来越多的lncRNA被注释，但是绝大多数的lncRNA的功能仍然不清楚，因此lncRNA的研究是一片非常广阔的未知领域，具有极大的研究价值和意义。lncRNA介绍长链非编码RNA（longnon-codingRNA，lncRNA）是一类转录本长度超过200nt、不编码蛋白的RNA。lncRNA起初被认为是基因组转录的“噪音”，不具有生物学功能。然而，近年来的研究表明lncRNA能在表观遗传、转录及转录后水平上调控基因表达，参与了X染色体沉默、基因组印记以及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程，与人类疾病的发生、发展和防治都有着密切联系。为何细胞不惜耗费能量对这些非编码RNA的表达和定位进行严格调控呢？这些RNA分析究竟有何功能？RNA测序技术的发展使人们得以初窥这一神秘分子，现在lncRNA的许多相关信息都可以再新数据库中查到，例如Broad研究所、哈佛大学和麻省理工共同开发的HumanBodyMaplincRNAscatalog。虽然近年来关于lncRNA的研究进展迅猛，但是现在人们了解到的lncRNA只是冰山一角，绝大部分的lncRNA的功能仍然是不清楚的。随着研究的推进，各类lncRNA的大量发现，lncRNA的研究作为RNA研究的新领域，已经成为一个非常吸引人的方向，有待广大科学家去探寻。lncRNA研究当前面临的一个主要挑战是，研究工具还在不断开发和改进中，而lncRNA研究中非常关键的一步就是发现与特定疾病相关的lncRNA。现阶段，基因芯片技术发展趋于成熟稳定，在此平台上，通过设计不同检测lncRNA探针筛选lncRNA是一种准确快捷的方法。lncRNA特征lncRNA通常较长，具有mRNA样结构，有些具有poly(A)尾巴，有些没有poly(A)尾巴，分化过程中有动态的表达与不同的剪接方式，与编码基因相比，lncRNA表达量更低。※组织特异性：不同组织之间的lncRNA表达量不同。※时空特异性：同一组织或器官的不同生长阶段，其中的lncRNA表达量也会变化。※lncRNA启动子同样可以结合转录因子，如Oct3/4，Nanog，CREB，Sp1，c-myc，Sox2与p53，局部染色质组蛋白同样具有特征性的修饰方式与结构特征。※大多数的lncRNA在组织分化发育过程中，都具有明显的时空表达特异性，如有人针对小鼠的1300个lncRNA进行研究，发现在脑组织中的不同部位，lncRNA具有不同的表达模式。※在肿瘤与其他疾病中有特征性的表达方式。※lncRNA的亚细胞位置上也呈多样化，在细胞核、细胞质和细胞器均有分布，甚至某些lncRNA具有独特的亚细胞位置，有可能是全新的亚细胞构成。lncRNA功能lncRNA可从染色质重塑、转录调控及转录后加工等多种层面实现对基因表达的调控：a)lncRNA通过招募染色质重塑复合物至特定的基因组位点使其发生催化活性。如HOTAIR21，Xist、RepA和Kcnqot1招募Polycombcomplex至HoxD位点，使得X染色体或Kcnq1功能域的组蛋白H3第27位赖氨酸发生3甲基化（me3K27），诱导异染色质形成，从而抑制该区域基因表达。b)lncRNA通过多种机制进行转录水平调控。lncRNA结合到基因cyclinD1上，招募RNA结合蛋白TLS来调控蛋白CBP和p300的组蛋白乙酰转移酶活性，进而抑制cyclinD1转录。c)超保守增强子转录出lncRNA-Evf2，该lncRNA能激活转录因子DLX2，进而调控基因Dlx6转录。d)DHFR次要启动子区域转录出的lncRNA与该基因主要启动子区域结合形成三聚体，抑制转录因子TFIID结合，从而使基因DHFR发生沉默。e)反义lncRNA能够与剪接体（splicesome）中锌指同源mRNAZeb2的5'剪切位点结合，使内含子未被剪切掉，而该内含子序列中保留有内部核糖体进入位点（IRE位点），翻译过程中识别并结合该位点，导致Zeb2基因表达和翻译。lncRNA分子机制随着lncRNA功能逐步显现，其与靶点的作用机制成为进一步的热点。早期认为原位调控是LncRNA作用的唯一机制，它通过招募形成染色质修饰复合物而沉默邻近基因转录，例如IGF2R反义RNA(antisenseofIGF2RRNA，AIR)、XIST等。而Hox基因反义基因间RNA(HoxantisenseintergenicRNA，HOTAIR)的发现提示LncRNA可能存在远程调控。同源异型基因(homeoticgenes，HOX)在细胞增殖与定向分化中起关键作用，人类Hox基因簇约含100个ncRNA基因，其中HOTAIR定位于HOXC基因座12q13.13。HOTAIR的5'端可招募结合多梳蛋白抑制复合物2(polycombrepressivecomplex2，PRC2)，借助PRC2上三个H3K27甲基化酶EZH2、SUZ12和EED，使另一基因座HOXD上长约40kb的序列转录沉默，从而在乳腺上皮细胞内使细胞内转录倾向于胚胎成纤维细胞样表型。超过20%的LncRNA能够通过结合PRC2或其他类似复合物发挥作用，提示LncRNA的远程调控机制在生物体内广泛存在。其作用机制如下图所示，主要包括以下几种情况：1)在编码蛋白基因的上游启动子区（橘色）转录，从而干扰邻近蛋白编码基因（蓝色）的表达（如酵母SER3基因）；2)抑制RNA聚合酶Ⅱ，或介导染色质重构和组蛋白修饰，而影响基因（蓝色）表达；3)lncRNA（紫色）与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，干扰mRNA的剪切，进而产生不同的剪切形式；4)lncRNA（紫色）与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，在Dicer酶作用下产生内源性的siRNA，调控基因的表达水平；5)lncRNA（绿色）结合在特定蛋白质上调节相应蛋白的活性；6)作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体；7)结合在特定蛋白上从而改变该蛋白的胞质定位；8)可作为小分子RNA（如miRNA）的前体分子。lncRNA芯片数据分析策略1)芯片数据预处理：对实验数据质量评估，预处理及均一化处理。2)差异表达lncRNA及mRNA的筛选：根据客户提供样本量的大小与分布或实验目的，应用倍数法、多重假设检验等手段，对两条件或多条件下的表达差异的lncRNA和mRNA分别进行计算和筛选。※表达模式聚类