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第四章微生物细胞破碎微生物代谢产物大多分泌到细胞外，如大多数小分子代谢物、细茵产生的碱性蛋白酶、霉菌产生的糖化酶等，称为胞外产物。但有些目的产物存在于细胞内部、如大多数酶蛋白、类脂和部分抗生素等，称为胞内产物。许多基因工程产品都是胞内产物。分离提取胞内产物时，首先必须将细胞破碎，使产物得以释放，才能进一步提取。因此细胞破碎是提取胞内产物的关键步骤。第一节细胞壁的组成与结构细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁，不同类型的微生物其细胞壁的结构特性是不同的。一、细菌细胞壁主要化学成分：肽聚糖；主要阻力—肽聚糖的网状结构。二、酵母菌细胞壁主要化学成分：葡聚糖(30％一34％)、甘露聚糖(30％)、蛋白质(6％一8％)和脂类；主要阻力—壁结构交联的紧密程度和它的厚度。三、霉菌细胞壁主要化学成分：几丁质和葡聚糖；主要阻力—几丁质或纤维素的纤维状结构。细胞壁结构与细胞破碎：细胞个体小、球形、壁厚、聚合物交联程度高是最难破碎的。OCH2OHOOOHHNCCH3O**n几丁质结构第二节常用破碎方法方法很多，按其是否使用外加作用力可分为机械法和非机械法两大类。机械法：有珠磨法、高压匀浆法、超声破碎法等。在机械破碎法中，由于消耗的机械能转为热量会使温度上升，在大多数情况下要采用冷却措施，以防止生物产品受热破坏。非机械法：有酶溶法、化学法、物理法和干燥法等，其中某些方法的应用受到限制。目前人们仍在探寻新的细胞破碎方法。一、珠磨法珠磨法特点破碎率较高适合大规模细胞破碎碎片较小，胞内物质释放完全温度容易急剧上升，需要良好的降温配套设备相对与酵母和细菌，珠磨法更适合真菌菌丝和藻类影响细胞破碎的因素搅拌速度（700～1450r/min）料液的循环速度（50～500L/h）细胞浓度（0.3～0.5g/mL）珠粒大小和填充量（0.45～1mm；70％～90％)二、高压匀浆法高压匀浆器高压匀浆法特点破碎率较高适合大规模细胞破碎碎片细小，胞内物质释放完全适合格兰氏阳性菌和酵母的破碎，不适合霉菌合格兰氏阴性菌影响因素操作压力（50～70MPa）细胞浓度（20％）温度循环次数(2~5)三、超声破碎法超声破碎通常采用的超声破碎机在15—25kHz的频率下操作。其破碎机理尚未完全清楚，可能与空化现象引起的冲击波和剪切作用有关。超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型等因素有关。对不同菌种的发酵液．超声破碎的效果差别较大。一般地，杆菌比球菌较易破碎，革兰氏阴性细菌细胞比革兰氏阳性细菌细胞较易破碎，对酵母菌的效果较差。优点：操作简便，液量损失少，适合实验室规模。缺点：易引起温度的剧烈上升，在大规模操作中，声能传递和散热困难，产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。电声超声波发生器四、酶溶法利用酶反应,分解破坏细胞壁上的特殊键，从而达到破壁的目的。1.外加酶法:常用的溶酶有溶菌酶、β-1，3-葡聚糖酶、β-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽键内切酶、壳多糖酶等，而细胞壁溶解酶是几种酶的复合物。其中溶菌酶主要用于细菌类，其他酶对酵母作用较显著。2.自溶法:影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH、激活剂和细胞代谢途径等。微生物细胞的自溶法常采用加热法或干燥法。五、化学渗透法(1)表面活性物质:可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。(2)EDTA螯合剂:革兰氏阴性菌的外层膜结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。(3)有机溶剂:能分解或溶解细胞壁中的类脂。(4)变性剂:变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。化学渗透法有如下优缺点：优点：(1)对产物释放具有一定选择性。(2)细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。缺点：(1)通用性差，某种试剂只能作用于某些特定类型的细胞。(2)时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50％。(3)有些化学试剂有毒性，在其后的产物提取精制过程中需设法分离除去。第三节破碎率的测定与破碎技术的研究方向一、破碎率的测定1．直接测定法2．目的产物测定法3．导电率测定法二、破碎技术的研究方向1．多种破碎方法相结合2．与上游过程相结合3．与下游过程相结合