丝裂原

（1）PHA（ConA）是植物血凝素类多克隆刺激剂，通过细胞表面的CD3-TCR复合体作用于T细胞，PHA适合刺激人的T细胞增殖，ConA则对小鼠T细胞增殖作用更强一些。它们诱导细胞活化、增殖后都会在培养72h后发生明显的AICD（活化诱导的细胞死亡）现象，尤其是在大剂量情况下，5ug/ml是比较常规的剂量，如果想培养时间更长一些，可以试着降到1ug/ml。需要注意的是这类刺激剂是APC依赖性的，也就是说不能诱导完全纯化的T细胞增殖，培养体系中多多少少要混有一些APC才可以。（2）单独anti-CD3包被在板上能刺激纯化T细胞增殖，加入anti-CD28作用更强，如果是可溶性anti-CD3就要加入射线照射过的APC。（3）PMA＋Ionomycin作为多克隆刺激剂，也是APC非依赖性的。PMA是DAG（二酯酰甘油）类同物，可以自由进入细胞膜，模拟DAG直接作用于细胞内的PKC（蛋白激酶C）；inonomycin是钙离子载体，使细胞外Ca2+内流，PKC和Ca2+产生的信号共同作用于核内的转录因子，启动活化相关的基因转录和后续蛋白合成。由于PMA可直接进入细胞内作用于活化信息通路的中下游，因此作用最快，2h即可检测到明显的活化相关蛋白的从头合成。三者比较，PMA＋Ionomycin的作用最快，PHA（ConA)其次，anti-CD3作用更柔和和慢一些。但CFSE染色可见48h或72h后，PHA组较PMA＋Ionomycin分裂代数更多。这三类刺激剂均不需要加IL-2即可诱导T细胞增殖（调节性T细胞除外），额外加入IL-2可使增殖更强或维持时间更长，因为大量细胞活化，时间长了IL-2饥饿也可诱导细胞凋亡。MouseCytokineCellSourceActivationIncubationTimeIL-2mousespleenConA(3ug/ml)(2d)/IL-2(20ng/ml)+IL-4(20ng/ml)(3d)2d/3dIL-4mousespleenConA(3ug/ml)(2d)/IL-2(20ng/ml)+IL-4(20ng/ml)(3d)2d/3dIL-6mousespleenConA(3ug/ml)(2d)/IL-2(20ng/ml)+IL-4(20ng/ml)(3d)2d/3dIL-10mousespleenConA(3ug/ml)(2d)/IL-2(20ng/ml)+IL-4(20ng/ml)(3d)2d/3dIL-12mousethioglycolate-elicitedperitonealcellsConA(3ug/ml)(2d)/IL-2(20ng/ml)+IL-4(20ng/ml)(3d)2d/3dGM-CSFmousespleenConA(3ug/ml)(2d)/IL-2(20ng/ml)+IL-4(20ng/ml)(3d)2d/3dIFNgmousespleenConA(3ug/ml)(2d)/IL-2(20ng/ml)+IL-4(20ng/ml)(3d)2d/3dTNFamousespleenConA(3ug/ml)(2d)/IL-2(20ng/ml)+IL-4(20ng/ml)(3d)2d/3dHumanCytokineCellSourceActivationIncubationTimeIL-2PBMCPMA(30-50ng/ml)/Iono(1ug/ml)5hrIL-4PBMCPMA(30-50ng/ml)/Iono(1ug/ml)5hrIL-6PBMCLPS100ng/ml5hrIL-10PBMCLPS100ng/ml24hrIL-12PBMChIFNg(100ng/ml)(2hr)/LPS(100ng/ml)(22hr)2hr/22hrIFNgPBMCPMA(30-50ng/ml)/Iono(1ug/ml)5hrTNFaPBMCPMA(30-50ng/ml)/Iono(1ug/ml)5hr致有丝分裂原受体：致有丝分裂原（mitohen）是指能刺激细胞发生有丝分裂的物质。在免疫学中，主要是指刺激多克隆淋巴细胞增殖的物质。不同的致有丝分裂原对T细胞和B细胞有作用有很大差别。常用的诱导T细胞发生增殖的致有丝分裂原有刀豆素A（concanavalinA,ConA）,植物血凝素（phytohemagglutinin,PHA）和PWM。在临床上常用PHA来刺激人外周血的T细胞，观察T细胞增殖的程度，称为淋巴细胞转化试验（lymphocytetransformationtest）,是一种细胞免疫功能的体外检测方法。被转化的淋巴细胞表现为细胞体积增大，胞浆增多，细胞核着色变浅，疏松，可见到核仁。外源凝集素（lectin）是指来自植物种子中可与某些糖和寡糖特异性结合的蛋白质，大多数外源凝集素分子含有2个或4个同源亚单位，可与细胞膜表面的糖或寡糖结合而凝集细胞。许多外源凝集素如PHA、ConA和PWM等可作为致有丝分裂原，在免疫学中广泛用于刺激淋巴细胞的增殖。名称来源分子量（kDa）糖特异性特性及应用刀豆素A刀豆102α-D-mannosyl-T细胞促有丝分裂原，（ConA）（jackbean）α-D-glucose分离细胞膜糖蛋白植物血凝素肾豆120N-acetyl-D-T细胞促有丝分裂原（PHA）（kidneybean）galactosamine美洲商陆丝美洲商陆32β-N-acetyl-D-B细胞、T细胞促有丝裂原（PWM）（pokeweed）glucosamine分裂原花生凝集素花生110D-glalctosyl-分离胸腺细胞亚群（PNA）（peanut）(β1-3)-N-acetyl皮质不成熟胸腺细胞PNA+）D-galactosamine凝集免疫活性B细胞，大豆凝集素大豆120N-acetyl-D-galac-净化人骨髓，用于骨髓移植（SBA）（soybean）tosamineD-galactose对于IL-2的检测，目前常用的是酶联检测法（ELISA法）。IL-2的ELISA试剂盒可在许多生物公司买到，它的优点是特异性和敏感性都高，可定量检测（一般都能测到pg/ml水平），缺点是可能价格不菲，但最大的好处还是在于操作简便，在短时间内就得到结果。一般不用流式法检测IL-2的分泌，因为检测步骤相对较繁，且需要流式细胞仪。流式法检测时，只能检测细胞浆内的IL-2，而不能检测已分泌到细胞外的IL-2，也就是说，不能定量检测，所以只能在特殊情况下用流式法检测。至于用RT-PCR检测，似也没有必要，因为RT-PCR检测，也只能定性检测，不能定量检测，而且操作繁。如想定量检测，只能采用Real-timePCR检测，但价格昂贵，操作也繁。上世纪80年代初期，基因工程水平还没有发展到现在的水平，没有基因工程重组的IL-2，也就没有制备针对IL-2的抗体，根本谈不到ELISA法检测，所以那时采用的CTLL细胞法。CTLL细胞是小鼠的T细胞系，它的体外培养和生长高度依赖IL-2（无论是鼠的或人的），所以CTLL细胞法也能定量检测IL-2，只不过是定量出IL-2的活性单位。用PHA刺激Jurkat细胞或T细胞时，对PHA必须谨慎小心，分清PHA是国产货还是进口货。早期的PHA是粗制品，里面既包含可刺激T细胞的丝裂原，也包含可凝集红细胞的凝集素以及其他成份，所以用量很大。以后将PHA精制了，将丝裂原提纯，现在用量就大大降低了，现在看文献上PHA的用量只有原来的几十分之一，但现在的国产PHA仍然是粗制品。如将国产PHA按进口PHA那样使用，也就可能得不到所需的实验结果。除PHA外，可考虑用ConA试试。淋巴细胞增殖和分化是机体免疫应答过程的一个重要阶段。因此，检测淋巴细胞增殖水平是细胞免疫研究和临床免疫功能检测的一种常用方法。(一)原理T细胞、B细胞表面具有识别抗原的受体和有丝分裂原受体，在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖。植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白A(ConA),抗CD２、抗CD３McAb作为多克隆刺激剂可选择性地刺激T细胞增殖；而抗IgM、含葡萄球菌A蛋白的菌体(SAC)、脂多糖(LPS，对小鼠有作用)则刺激B细胞发生增殖；美洲商陆(PWM)、肿瘤刺激剂PMA对T、B细胞的增殖均有刺激作用。最近发现,integrin家族中VLA组中某些受体与相应配体结合后也能活化T细胞。目前临床上最常选用PHA刺激PBMC,根据形态学或氚标记胸腺嘧啶核苷(３H-TdR)掺入率测定T细胞的增殖水平。(二)操作步骤无菌从肝素抗凝血中分离外周血单个核细胞(PBMC)洗涤后用10％FCSRPMI1640调整细胞数为1～2×10６／ml↓加入96孔培养板中，1～2×10５细胞／100μl／孔，每组设3孔。加入最适剂量PHA，100μl／孔，同时设不加PHA阴性对照。如观察细胞因子(如IL-2)或其它刺激物(PMA)对增殖功能的调节作用，则根据加入因子的浓度而确定加入量，一般每孔最终体积为200μl↓37℃、5％CO２孵育，66h每孔加入0.5～1μci３H-TdR(50μl)↓继续培养6～12h用DYQ-Ⅱ型多头细胞收集仪收集样品于9999型玻璃纤维滤纸上↓烤干后β液闪仪计数计算1.增殖水平直接用CPM值表示。2.也可用刺激指数(SI)表示:PHA(或实验组)cpm-机器本底SI＝───────────────阴性对照组cpm-机器本底(三)试剂和器材1.PBMC或其它含淋巴细胞的悬液。2.PHA或其它有丝分裂原、刺激物3.闪烁液PPO(2，5-二苯茎恶唑)3～5gPOPOP[1，4双(5苯基恶唑)苯]0.3～0.5g溶于1000ml二甲苯中。也可将POPOP加入少量二甲苯在37℃水浴上溶解后，再加PPO，然后补足二甲苯。4.３H-TdR，一般临用时稀释5.10％FCSRPMI1640,CO２孵箱6.细胞收集仪，β液闪仪(四)注意事项1.注意无菌操作。2.PHA、ConA、PWM、LPS等在正式实验前均需摸索最适剂量或亚适剂量。犛I于厂家和批号不同丝裂原作用常有很大差别，3.MTT法可以参照本法采用3H-TdR掺入率测定淋巴细胞增殖功能由江苏大学附属医院李晶教授整理供细胞培养的刚入门者参考（请加分）一、仪器、材料及试剂1、BeckmanLS-9800型液体闪烁计数仪，或BeckmanLS6500型液体闪烁计数仪2、多头细胞收集仪3、3H-TdR（比活性为2Mci~10Mci/mg分子）。3H-TdR工作液：将1Mci/ml溶液以生理盐水稀释成100μci/ml，于4℃保存备用。临用时再用培养液稀释成10μci/ml溶液。３H-TdR一般临用时稀释。4、闪烁液：PPO（2，5-二苯基恶唑）、POPOP(1，4-双-2-15-苯基恶唑苯)Sigma公司。ppo5.0gpopop0.1～0.3g加二甲苯或甲苯至1L；POPOP加入少量二甲苯在37℃水浴上溶解后，再加PPO，然后补足二甲苯。配好的闪烁液需要闭光。闪烁液配制和检测的样品有关：二、操作步骤1、分离淋巴细胞（可来自外周血，脾细胞等）：↓2、洗涤后用10％FCSRPMI1640调整合适的细胞数（2×10６／ml）↓3、加入96孔培养板中，2×10５细胞／100μl／孔，每组设3孔。↓4、加入最适剂量PHA或ConA，100μl／孔，同时设不加PHA或ConA阴性对照。一般每孔最终体积为200μl（细胞终浓度1×10５）。↓37℃、5％CO２孵育，66h（20h后根据实验加药）5、每孔加入0.5～1μci３H-TdR(50μl)↓继续培养6～12h6、培养结束后，离心吸去上清液，用200μl冷PBS洗涤二次（2000r/min离心10min）。用冷PBS可以终止反应↓7、用DYQ-Ⅱ型多头细胞收集仪收集样品，于9999型玻璃纤维滤纸（玻璃纤维素膜）上。蒸馏水抽洗至少2次。↓8、取出滤膜，排列好，置于干燥箱中，60℃~80℃，30min烘干（或75℃烤箱过夜）。对号剪下各个滤膜片，然后将滤膜放入装有5ml的闪烁液中(贴细胞的面朝上)。闪烁瓶暗处放置15min。