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测钙原理：Fura-2是一种荧光指示剂可与胞内的游离钙离子特异结合，其游离（未结合）形式的Fura-2比与钙结合形式的Fura-2在更长的波长上被激发，即：结合形式的Fura-2激发波长为340nm，游离形式的Fura-2激发波长为380nm。因此通过检测两个激发波长上荧光强度的比率，就可以确定结合钙的Fura-2与未结合的Fura-2的比例，进而利用Grynkiewicz公式可求游离Ca2+的浓度。Grynkiewicz公式：〔Ca2+〕i＝Kd×β（R-Rmin）×（Rmax-R）其中，Kd为Fura-2和Ca2+结合的平衡解离常数,β是胞内零钙和饱和钙时在380nm的荧光强度比值,R是Ratio比值，Rmin是零钙时Ratio值，Rmax是饱和钙时的Ratio值。Fura-2Ratio法可用于测定组织块、器官、人工培养的单层贴壁细胞、血小板等胞内的游离钙。以下以人工培养的单层贴壁细胞为例介绍实验方法：此检测方法定量，具有快速，灵敏等优点。测钙样品准备：材料与方法试剂：1.DMSO溶液：配置10ml的含20％F127的DMSO母液。2.Fura-2/AM溶液：使用含20％F127的DMSO溶液溶解成1mM的母液。如：使用1ml20％F127的DMSO溶液溶解1mgFura-2AM。分装Fura-2AM（1mM的stocksolution）成1ul一管，储存于－70度冰箱，可以使用1年以上。此试剂购自molecularProbe公司。3.K2H2EGTA，K-MOPS，KCI，CaCl2，二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO），多聚赖氨酸，Tris等均购自sigama公司。PluronicF-127（表面活性剂有助于负载染料进入细胞），牛血清蛋白（albuminbovine，BSA，电泳纯）（与PluronicF-127的功效类似）等试剂可购自Amresco公司。此外，上海生工、Invitragon（molecularProbe的代理、大连宝生等试剂公司均可提供相应试剂。4.配制校正Kd值的缓冲溶液：a.1mMCaCl2溶液b.1mMEGTA溶液c.MOPS缓冲液：100mMKCl，100mMKMOPS。d.0.1mMCaCl2：取10体积的1mMCaCl2，加入90体积的MOPS缓冲液，混匀。e.制备饱和钙溶液：取10ml1mM的EGTA溶液，然后缓慢的加入0.1mMCaCl2，边加CaCl2边测PH值，会发现PH值降低，但加CaCl2到一定的体积后PH值稳定不再降低，记下此时所需的CaCl2体积V（一般情况下，不超过5ml）。注：以上试剂的浓度较低，可先配制较高浓度的母液，稀释到所需的浓度。5.校正Kd的Ca-EGTA溶液溶液A（零钙溶液）：100mMKCI，10mMK-MOPS，10mMK2H2EGTA，然后用KOH溶液调其PH值到7.2。配20ml溶液A，然后分装成两份，每份10ml。溶液B（高钙饱和溶液）：此溶液的制备依据e饱和钙液的制备方法。取10ml的溶液A，缓慢加入Vml1mM的CaCl2（V是制d饱和钙液时的CaCl2体积数），然后KOH调节PH值到7.2。注：溶液A、溶液B，都可从试剂公司，如Invitragen公司购买molecularprobefura-2专用校正试剂盒，使用非常方便。制备梯度标准Ca-EGTA溶液：溶液A和溶液B按各种比例混合（0-100％）。见表1。表1制备标准Ca-EGTA溶液溶液序号CaEGTA〔Ca2+〕free溶液A溶液B00.00mM0uM2.00ml0.00ml11.00mM0.017uM1.8ml0.2ml22.00mM0.038uM1.778ml0.222ml33.00mM0.065uM1.750ml0.250ml44.00mM0.1uM1.714ml0.286ml55.00mM0.15uM1.667ml0.333ml66.00mM0.225uM1.600ml0.40ml77.00mM0.351uM1.500ml0.50ml88.00mM0.602uM1.333ml0.667ml99.00mM1.35uM1.00ml1.00ml1010.00mM39uM0.00ml2.00并且使最终的0、1、2……10溶液均含有Fura-2/AM，终浓度均为2ug/mL，PH7.2。6.负载溶液配制：试剂储存液A：用无水的DMSO配置3mmol/L的fura-2/AM（fura-2/AM浓度与细胞有关，其值在1-10mmol/L之间）溶液。储存液B液：10％（W/V）的pluronicF-127负载溶液I（mmol/L）：130NaCl,3.5KCl,1.25NaH2PO4,1.5MgSO4,2.0CaCl2,24NaHCO3,10葡萄糖，pH值调至7.2。储存液C液：用负载溶液I配制20mg/ml的BSA组分溶液。负载溶液II：按比例混合A、B、C液，其最终比例为A：B：C＝10：15：9756.封片液（缓冲甘油）：取1份pH9.5的0.5mol/L碳酸缓冲液（0.5mol/LNa2CO3:0.5mol/LNaHCO3，1:3，v/v）与9份甘油（试剂级，无荧光）经搅拌器彻底混合后，4℃冰箱保存备用。7.超纯水（如Milli-Q超纯水，其电导率不小于18M欧姆）实验材料准备：将活化后的细胞接种到培养瓶中，置于CO2培养箱中培养（37℃、5％CO2），隔日更换培养基。待细胞铺满培养瓶底时，用0.25％的胰蛋白酶消化，消化完全后加入终止液终止消化，用吸管吹打均匀，接种入培养板中。培养24h后可用于测定胞内钙离子浓度。实验步骤：一、校正Kd值Kd值是荧光信号和离子强度转换的很关键的参数，其值与温度、PH、离子强度等密切相关。常用的校正方法主要包括：体外校正法和体内校正法。体内校正法又可分为负载法、微注射法、细胞膜穿孔法、离子电渗法和电迁移法等等，其中负载法较常用。可按试验需求选用合适的校正方法。1.体外校正Kd值1.按表1的制备方法制备一系列的钙标准溶液，然后分别取5ul的溶液0、1、2、3……10滴到培养皿底部，盖上18×18的盖波片。注：培养皿经过特殊处理（底部带有特殊的盖玻片小室）、盖玻片需清洗彻底、凉干，消除污染物所带来的背景荧光。2.在显微镜下分别观察编号0、1、2、3…10的培养皿，分别在340nm、380nm激发，510n发射成像的F340、F380以及相应的Ratio值。&bsp;&;&bsp;&sp;3.根据已知的钙离子浓度和对应的Ratio值作曲线，然后以log〔Ca2+〕为X轴，log（R-R0）/log（Rmax-R）为Y轴，作标准曲线。标准曲线在X轴的截距是–logKd值，从而可求出校正后的Kd值。注：为便于观察（如调焦）、保持盖玻片和载玻片的间隙，可在钙标准溶液中加直径15um的微球体悬浮物，密度达16000/ml（如购买fura-2校正试剂盒可付送微球体悬浮物）。注：Kd与环境因子，如温度、PH、离子强度、染料与蛋白间的相互作用等因素相关，因此对系统进行Kd校准很关键。2.胞内校正Kd值（采用负载法）1.按表1制备一系列的钙标准负载溶液0、1、2、3、……10。其中，溶液A和溶液B均是采用负载溶液配制（注：采用高钙的校正浓度最高不超过2mM，所有溶液的Fura-2/AM的终浓度均为2ug/ml）。2.取贴壁生长的细胞培养皿11个，依次编号0、1、2、3、……10，并将培养皿的培养液弃去，分别用Ionomycin或者4-bromo-A23187（10um处理浓度，目的：破细胞膜使胞外的钙离子自由进入胞内），然后负载溶液I轻轻漂洗3次。生长面朝上，在上面分别滴加约0.5-1ml的负载溶液II（含有Fura-2/AM染液）。3.室温孵育30分钟左右，间或轻轻晃动几次。4.孵育完毕后，用负载溶液I轻轻漂洗3遍，以除去胞外残余的Fura-2/AM。5.制片，待检。利用显微镜Ca2+比率成像系统，检测在340nm、380nm激发的荧光强度值如F340、F380和对应的Ratio值。6.根据已知的标准钙离子浓度和对应的Ratio值作曲线，然后以log〔Ca2+〕为X轴，log（R-R0）/log（Rmax-R）为Y轴，作标准曲线。标准曲线在X轴的截距是–logKd值，从而可求出校正后的Kd值。7.体内校正Kd法，可同时校正Rmin、Rmax和β值。其中，零钙：可测得F380和Rmin；高钙：测得对应的F380和Rmax，从而可以求出β值。注1：荧光显微镜下观察到负载后的细胞呈绿色，则表明负载成功，即荧光染料进入细胞。当荧光标记的信号较低时，细胞内表现为紫色；当荧光信号增加时，胞内颜色由亮蓝色-黄色-红色。注2：将指示剂导入细胞的方式有几种：（1）用微注射法将探针直接注入细胞内，适合于较大的细胞，限制比较多，而且容易产生损伤；（2）用荧光探针的酯化衍生物和细胞共同孵育法；（3）离子电渗法和电迁移法（主要通过电场作用影响细胞膜的渗透性，适合于带电荷的染料）。其中（2）法简单、方便较广泛采用。但是，也有研究发现Fura-2的酯化形式会大量沉积在细胞的分泌颗粒中被排到胞外，引起荧光的损失。注3：测荧光强度时，为排除背景的干扰，校正R＝（F340-Fb）/（F380-Fb）。其中，Fb是细胞背景的荧光强度，SimplePCI软件可直接扣除背景的荧光强度，计算校正后的R值。二、校正Rmin、Rmax和β值。方法：利用体内校正Kd的Rmin、Rmax和β值。三、Fura-2/AM负载入细胞1.小心取出培养有细胞的培养皿，用负载溶液I轻轻漂洗3次；生长面朝上，在上面分别滴加负载溶液II（Fura-2/AM染液的终浓度为2ug/ml）；2.将细胞放置于37℃细胞培养箱中，避光负载20-30min，3.用负载溶液I冲洗细胞1-3次，将细胞放置在37℃(25度或室温)下避光孵育，20-30min。制片，待检。4.结合CalciumFura-2检测参数：Ex=340nm,Em=510nm；游离Fura-2检测参数：Ex=380nm,Em=510nm。注1：具体操作可结合实际给药操作，适当调整。注2：负载用的细胞培养皿，经多聚赖氨酸处理有利于细胞贴壁和生长。多聚赖氨酸处理的步骤：将无菌的浓度为1mg/ml的多聚赖氨酸Tris缓冲溶液（0.15mol/L,PH8.4）约0.25ml滴在洁净无菌的培养皿底部过夜，使多聚赖氨酸粘附在培养皿底部。第二天吸去多余的多聚赖氨酸溶液，依次经去离子水、Tyrode溶液和去离子水浸洗两次。空气干燥并用紫外光照射15分钟后即可使用。四、Fura-2/AM负载培养细胞的瞬间胞内钙动态变化的测量将待检样品放在显微镜载物台上观察，通过Hamamatsu钙离子检测系统（HamamatsuAGCCD+SimplePCI软件系统+ZeissAxiovert200倒置荧光显微镜）进行实时监测测定。在相同的环境下（同一光学系统、同一温度、恒定的曝光时间等）340nm和380nm间激发成像，测定一定时间序列胞内钙离子的荧光强度F340、F380、Ratio和钙离子浓度的变化。注：1.R值也是校正后的Ratio＝（F340-Fb）/（F380-Fb）。2.先测静息状态的钙离子浓度，待其值稳定后，可对给药细胞检测钙离子的浓度变化情况。五.成像系统实时检测过程与数据处理1）通过软件设置CCD、DG-4的控制参数：设定340nm、380nm滤光片自动切换时间、曝光时间等。2）在电脑上成像后，建立背景ROI，计算背景光密度值Fb以扣除背景。3）通过软件自动识别细胞样品，建立样品ROI区域。4）自定义计算参数F340、F380、R=（F340-Fb）/（F380-Fb）、[Ca2+]i=KDxßx(R-Rmin)/(Rmax-R)。实时输出细胞340/380nm的荧光光密度比率变化曲线图和游离Ca2++的浓度变化曲线图，并存储数据。