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抗体诊断试剂的应用之一吗啡检测试剂什么是吗啡？前言原理制备标记展望罂粟麻醉药摇头丸等前言原理制备标记展望A：吗啡(Morphine）是一种精神科药物，以口服形式为主。因为吗啡具有梦境一般的镇痛效果，所以科学家就以希腊神话当中的梦境与睡眠之神——摩耳甫斯的名称将这种麻醉式镇痛剂命名为“吗啡”。医学上叫盐酸吗啡。B：毒品，作为鸦片的主要有效成份，吗啡在鸦片中含量为百分之七至十四。海洛因、杜冷丁、美沙酮等都是吗啡的衍生物。通常连续用药一周以上即可上瘾。前言原理制备标记展望远离白色粉末，拥抱七彩生活soso吗啡检测试剂检测原理前言原理制备标记展望吗啡主要经肾脏以尿液形式排泄，吗啡原型占2-12%，大部分（占60-80%）为吗啡-葡萄糖酸甙。阿片类毒物（包括阿片、海洛因、吗啡、可卡因）进入体内后主要经肝脏代谢并快速去酰化成6-单乙酰吗啡，进一步分解为吗啡。因此，尿中吗啡或其代谢物的存在并超过阈值表明曾经使用过阿片类毒品。采用抗体-抗原特异结合反应及免疫膜层析技术，通过免疫竞争抑制法来检测人尿液中出现的吗啡。即蛋白标记的吗啡（吗啡载体）同尿液中存在的吗啡竞争有限的抗体上的抗原结合位点。胶体金免疫层析竞争法前言原理制备标记展望在试剂条检测区包被了吗啡-BSA载体结合物。在试剂条的另一端固定有吗啡单克隆抗体胶体金纸片。将试剂条插入尿液中，如果尿样中含有吗啡，尿液中的吗啡将与固定在硝酸纤维素膜的吗啡共同竞争标记在胶体金上的吗啡抗体上的抗原结合位点，当尿液中的吗啡浓度达到产品设计的阈值浓度以上时，它们会首先与胶体金纸片上的吗啡单克隆抗体反应并占据吗啡抗体全部的抗原结合位点，阻止了胶体金上吗啡抗体和膜上检测区的吗啡结合，检测区不能捕获到胶体金颗粒而没有红色色带呈现，为阳性结果。如果尿样中没有吗啡或吗啡的浓度低于阈值浓度，则胶体金上的吗啡抗体完全没有结合吗啡或者没有被饱和，这样胶体金上吗啡抗体将和膜上检测区的吗啡结合，检测区捕获到胶体金颗粒而呈现红色色带，为阴性结果。胶体金免疫层析竞争法前言原理制备标记展望胶体金免疫层析竞争法前言原理制备标记展望吗啡单克隆抗体胶体金纸片T线（检测线）吗啡-BSA载体结合物待检样品红色无色C线（质控线）羊抗兔IgG红色无色系统工作正常系统工作不正常抗原：吗啡-BSA载体复合物前言原理制备标记展望由于大部分毒物为低分子化合物,缺乏抗原性或仅为半抗原,不能诱发免疫反应。必须与大分子蛋白或合成的多肽等结合后方成为完全抗原,用它来免疫动物可产生对该毒物具有特异性的抗体。吗啡，分子量为285.33，是典型的半抗原。吗啡-BSA载体复合物前言原理制备标记展望吗啡一般指吗啡盐酸，首先需要使其转化为吗啡碱，然后与琥珀酸酐在无水吡啶中反应，生成吗啡半琥珀酸酯(MHS)，进而用氯甲酰异丁酯为缩合剂，将MHS与牛血清蛋白BSA结合．得到BSA-MHS复合物。MOR-OH琥珀酸酐无水吡啶M-6HSBSAM-6HS-BSA复合物抗吗啡单克隆抗体（mAb）前言原理制备标记展望杂交瘤技术抗吗啡mAb前言原理制备标记展望（1）抗原制备，即BSA-MHS复合物；（2）免疫动物：免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。抗吗啡mAb前言原理制备标记展望（3）免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备：选择瘤细胞株的最重要的一点是与待融合的B细胞同源。骨髓瘤细胞采用Sp2/0细胞株。该细胞株生长及融合效率均佳，此外，该细胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链。骨髓瘤细胞株在融合前应先用含8-氮鸟嘌呤的培养基作适应培养，在细胞融合的前一天用新鲜培养基调细胞浓度为2105/ml，次日一般即为对数生长期细胞。（4）细胞融合：采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。抗吗啡mAb前言原理制备标记展望（5）杂交瘤细胞的选择培养：选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。抗吗啡mAb前言原理制备标记展望（6）杂交瘤细胞的筛选：在制备单克隆抗体的时候，是要将效应B细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，最终获得既能在体外大量繁殖，又能产生特异性抗体的杂交瘤细胞。细胞融合的过程中会形成五种细胞即：A型、B型、AA型、AB型和BB型。其中两两融合的细胞就有三种，我们需要的只是AB型的，所以要进行第一次筛选，一般用HAT培养基即可筛选出来，选出杂交瘤细胞；再者在动物发生免疫反应的过程中，体内的B淋巴细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。所以要进行第二次的筛选，选出只分泌一种特异性抗体的杂交瘤细胞。抗吗啡mAb前言原理制备标记展望（7）杂交瘤细胞的克隆化：通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。抗吗啡mAb前言原理制备标记市场（8）单克隆抗体的鉴定：①效价测定：采用间接ELISA法。②Ig亚类的鉴定：按照试剂盒说明书进行。③特异性鉴定：利用吗啡分子进行阻断实验。按照分子摩尔比计算抗体与游离吗啡分子的结合效价，以20μg/ml的吗啡分别与1:104和1:105稀释的mAb室温作用10min，间接ELISA法检测。（9）分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立；抗吗啡mAb前言原理制备标记展望（10）单克隆抗体的大量制备：单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内诱生法和体外培养法。（1）体内诱生法取BALB/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石腊或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。（2）体外培养法将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。近年来，各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。IgG前言原理制备标记展望常用试剂，以下方法都可获得。①粗提法提取球蛋白：大多用硫酸铵盐析法或硫酸钠盐析法。②离子交换层析法提取IgG：常用的离子交换剂有DEAE纤维素或QAE纤维素。③亲和层析法提取特异性IgG：将纯化抗原或粗制抗原交联制成亲和层析柱，将抗血清过柱后洗去未结合的杂蛋白，再用硫氰酸钾洗脱，流出的是纯的特异性IgG抗体。④酶解法制备F（ab‘）2片段。胶体金免疫标记前言原理标记制备展望胶体金的制备前言原理标记制备展望取0.01％氯金酸水溶液100ml加热至沸，搅动下准确加入１％柠檬酸三钠水溶液0.7ml，金黄色的氯金酸水溶液在２分钟内变为紫红色，继续煮沸１５分钟，冷却后以蒸馏水恢复到原体积，如此制备的金溶胶其可见光区最高吸收峰在535nm，Ａ1cm/535=1.12。金溶胶的光散射性与溶胶颗粒的大小密切相关，一旦颗粒大小发生变化，光散射也随之发生变异，产生肉眼可见的显著的颜色变化，这就是金溶胶用于免疫沉淀或称免疫凝集试验的基础。金溶胶颗粒的直径和制备时加入的柠檬酸三钠量是密切相关的，保持其他条件恒定，仅改变加入的柠檬酸三钠量，可制得不同颜色的金溶胶，也就是不同粒径的金溶胶胶体金标记前言原理标记制备取已制备好的胶体金100ml，用0．1mol/LK2CO3，将胶体金溶液调至pH9.0；在磁力快速搅拌下迅速加人吗啡单克隆抗体1-2.0mg，电磁搅拌20min，在此过程中需加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀。常用稳定剂是5％牛血清（BSA）和1％聚乙二醇（分子量20KD）。采用超速离心法或者凝胶过滤法纯化胶体金标记蛋白。一般采用高速冷冻离心机于4℃、12000rpm/min离心30min；弃上清，沉淀即为胶体金一吗啡单抗结合物。展望mAb胶体金结合物鉴定前言原理标记制备展望（1）平均直径的测量：用支持膜的镍网（铜网也可）蘸取金标蛋白试剂，自然干燥后直接在透射电镜下观察。或用醋酸铀复染后观察。（2）OD520nm值测定：胶体金颗粒在波长510nm～550nm之间出现最大吸收值峰。（3）特异性与敏感性测定：采用微孔滤膜免疫金银染色法（MF－IGSSA）。将可溶性抗原（或抗体）吸附于载体上（滤纸、硝酸纤维膜、微孔滤膜），用胶体金标记的抗体（或抗原）以直接或间接染色法并经银显影来检测相应的抗原或抗体，对金标记蛋白的特异性和敏感性进行鉴定。前言原理展望制备标记目前国际上对吗啡检测通用的方法是先筛选后确认的方法，即首先采用一种方法对吸毒群体进行初步筛选，而后再对初筛结果显阳性的人体采用另一种方法进行确认。初筛方法往往较确认方法费用上更便宜，操作上简便，最好能是即时快速检测方法，现在常用的初筛方法有免疫层析试纸条检测法、酶联免疫分析法、放射免疫分析法等。确认方法主要用高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱一质谱法(GC．MS)等理化检测方法。通用检测方法前言原理展望制备标记胶体金免疫层析技术是在免疫层析的基础上建立的一种简单快速的免疫学检测技术，这种方法快速简便、准确，具有高度特异性和高敏感性，结果直观可靠，而且操作简单，试剂和样品用量极少，每个样品只需要几微升，同时也减小了因操作引起的误差，稳定性好，分析结果准确且易于判定，特别适用于吗啡现场的快速筛选监测分析，是一种目前发展最快的复合型免疫层析技术。胶体金免疫层析技术(GICA)前言原理展望制备标记目前市面上存在尿样吗啡胶体金免疫层析试纸条，在公安、医疗、招工和征兵等领域都有着广泛的应用，取得良好的经济效益及社会效益。但该厂品市场基本饱和，生产垄断厂家主要有上海凯创、宁波德宝、广州健仑、北京库尔等实力公司。新技术将成为各个厂家或者新兴厂家竞争市场份额的关键因素。胶体金免疫层析技术(GICA)前言原理展望制备标记市场上检测试剂主要针对尿液中的吗啡检测，或者针对血液的精准检测，而唾液中吗啡检测试剂或方法发现的报道还是很少。此外，正如上面所讲，胶体金免疫层析技术是属于初步检测，只能定性检测其存在，不能定量显示吗啡的指数。因此将其与其他物理化学方法结合，或者是研究新的可快速定量显示吗啡含量的试剂或者方法也渐渐提上日程。胶体金免疫层析技术(GICA)前言原理展望制备标记当今社会，氯胺酮(K粉)、甲基苯丙胺(冰毒)，吗啡，均为国家严控的一类精神药品和麻醉药品。氯胺酮、甲基苯丙胺和海洛因是当前非法滥用的3种主要毒品，此外还有200多种形形色色的毒品，并且新的品种还在不断产生之中。前景因此研制针对多种毒品的检测试剂或者多合一试剂盒已成为一种迫切需要。成员：曹静雯生物技术制药杜欣然、李彦霞、易海玲、王晓宁、周再铜、段锐、王俊、刘腾飞、索传圣、田永发曾世晓东谢谢