转基因、基因克隆与基因敲除技术

§5、转基因、基因克隆与基因敲除技术基因敲除技术、转基因动物模型、基因转染细胞模型、RNA干涉技术基因功能是在由细胞组成的器官组织中，在多层次的复杂生命体中实现的，因此对基因功能的研究只有在活体中才能接近真实的再现一个特定基因的表达和导致的后果；这是目前层次最高的实验体系，最好利用实验动物模型或细胞模型。--基因功能分析的方法。前言：一、利用转基因模型研究基因的功能概述1、转基因技术是指将外源基因导入受精卵细胞，胚胎干细胞中（或其它受体细胞），通过外源基因与受体细胞染色体DNA之间随机重组的发生而将外源基因插入到受体细胞染色体DNA分子上的过程。2、利用转基因技术可以制备转基因动物（植物）或转基因细胞。并被转入外源基因的动物或细胞能将将外源基因遗传给后代。3、利用动物（植物，细胞)模型研究未知基因的功能，就是将某一基因从动物基因组中剔除或将外源基因引入动物基因组（或让基因组中的某一基因过表达），产生在遗传上经过基因工程修饰（改造）的动物，实现在整体动物、细胞或分子水平上认识基因的功能或人类疾病发生的分子机制。（一）、转基因动物A、转基因动物：是指应用转基因技术培育出的携带外源基因的动物。B、制作转基因动物的操作过程：1、转基因载体的构建；2、将转基因载体导入受精卵细胞或胚胎干细胞；3、将转基因受精卵或胚胎干细胞植入假孕小鼠子宫内4、对转基因动物进行鉴定。1982年，首次成功获得转基因小鼠受精卵或着床前的胚胎干细胞活体组织检查转基因载体结构基因报告基因增强子启动子受精全能性细胞注射植入假孕小鼠后代SouthernblotRT-PCRWesternblot转基因小鼠C、转基因动物实例：转基因小鼠：获得来自大鼠的生长激素基因我国首例转基因牛“滔滔”1999，3，上海医学遗传研究所，曾溢滔，黄淑帧教授；携带人血清白蛋白。2001年，乳汁可分泌人乳球蛋白《环球时报》(2001年03月06日第七版)863计划图文：世界首例体细胞克隆鱼、转基因鱼在汉诞生荆楚网消息(湖北日报)1982年，中科院水生所采用细胞核连续移植的技术，从成年鲫鱼短期培养肾细胞，获得一尾完成发育的性成熟的体细胞克隆鱼。1984年，又培育出全球第一批转基因鱼。在此基础上，中科院水生所建立了完整的转基因鱼理论模型和完善的实验技术体系，拓展了鱼类基因工程育种研究的新领域。Example.Phenotypicanalysis☺PhenotypicAnalysisonfoundersharboringGFPgene(9.5dpc)GFP+,GFP-embryosGFP+tailGFP-,GFP+mice野生型小鼠转基因型小鼠野生型小鼠转基因小鼠哈医大生化教研室高旭教授制作的ALASE过表达转基因小鼠在紫外灯下呈现红色（野生型小鼠无此现象）例：Rubin人ApoA-I转基因小鼠，研究动脉硬化；Marban培养出具高胰岛素的小鼠模型等；北大医学部免疫学系制作了EB病毒BLLF1基因转基因小鼠，具淋巴瘤的发病特征、组织病理学的特点及遗传稳定性，证明该小鼠模型可能成为探讨淋巴瘤发病机制的动物模型。1、基因表达调控研究，包括基因表达时空特异性研究；2、基因新功能的研究；3、用于在胚胎期才表达的基因结构和功能研究；4、遗传性疾病的研究；5、建立人类疾病的动物模型（如Alzeimer’s病，糖尿病等模型），为人类的基因治疗提供依据；6、动植物新品种的培育；D、转基因动物应用：1、有时不能将外源基因定向地插入受精卵细胞染色体的特定部位；2、外源基因随机整合可能引起插入突变，破坏宿主基因组功能；3、外源基因随机整合在宿主染色体上的拷贝数不同，可能出现不同表现型；4、整合的外源基因遗传丢失而导致转基因动物症状的不稳定遗传。E、转基因技术存在的问题该技术是将动物的一个体细胞胞核导入另一个体的去除了胞核的激活的卵细胞内，然后置于代孕母体，使之发育成后代。这样的后代个体所携带的遗传性状仅来自一个父亲或母亲个体，因而也称无性繁殖，是一个个体的完全拷贝，故称克隆（clone)。有利于抢救频临灭绝的动物（二）、核转移技术，动物克隆技术“多利”的诞生1997年2月27日英国爱丁堡罗斯林(Roslin)研究所的伊恩·维尔莫特科学研究小组向世界宣布，世界上第一头克隆绵羊“多利”(Dolly)诞生，这一消息立刻轰动了全世界。世界上第个克隆羊—多利中国完成世界首例转基因克隆兔实验(图)左为克隆兔，右为代孕兔。2007年12月14日09:20:43来源：科技日报中国首例异种克隆动物“北山羊”在新疆降生2004美国科学家成功克隆灵长类动物韩国培养出世界上首批克隆狗A、基因转染细胞模型：是一种最常用的细胞水平的转基因模型，外源基因通过转基因过程被插入到细胞染色体中，使外源基因可以作为细胞染色体的一部分得以在细胞中稳定表达并遗传。（三）、稳定转染细胞—细胞模型1、α-synuclein（突触核蛋白)-转基因细胞模型用于研究帕金森氏病2、稳定转染APP瑞士突变基因cDNA的小鼠细胞-研究阿尔茨海默病3、GSK313（糖原合成酶激酶3β）转基因细胞模型-研究糖代谢障碍B、制作细胞模型（稳定转染细胞）的基本过程：1、真核重组表达质粒的构建：将外源基因和真核表达质粒连接构建成重组质粒；2、在原核细胞中复制扩增和克隆化真核重组表达质粒；3、将重组表达质粒转染哺乳动物细胞；4、重组质粒转染细胞的克隆化筛选、保存；5、转染细胞表达目的蛋白、提取、鉴定。二、基因敲除技术（一）、基因敲除的基本概念(geneknockout)1、基因敲除技术：是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。2、基因敲除动物：通过同源重组定向地在活体内剔除特定基因的动物称为基因敲除动物。目前基因敲除小鼠是应用最广泛的动物模型之一。（基因敲减）关于同源重组：homologousrecombinationHollidayintermadiate内切酶(recBCD)DNA侵扰(recA)分支迁移(recA)内切酶(recBCD)DNA连接酶5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´3´5´3´5´3´3´5´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´目录Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´5´5´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´内切酶(ruvC)内切酶(ruvC)DNA连接酶DNA连接酶拼接重组体目录片段重组体（二）、基因敲除的原理与程序A、制备基因敲除的胚胎干细胞1、打靶载体的构建：在一克隆载体上组装包括，待敲除的目的基因（同源臂），用于筛选的新霉素（Neor）基因和胸苷酸激酶基因(tk)。2、将构建的打靶载体转入胚胎干细胞，(为使靶载体上的新霉素基因能与干细胞内的目标基因发生同源重组而剔除目标基因)。3、筛选基因敲除的胚胎干细胞待剔除基因克隆克隆载体重组载体切割基因使待剔除基因失去活性阳性标记基因Neor连接HSV-tk打靶载体褐色大鼠胚胎干细胞A、制备基因敲除的胚胎干细胞这样打靶载体包含了：1、部分待剔除的基因片段，（用于与野生型的该基因进行交换重组）2、阳性筛选标志基因（Neor，neomycin-resistancegene)、使细胞具有抵抗G418（能被新霉素抵抗基因的表达产物分解）的能力。3、阴性筛选标志基因即胸苷酸激酶(thymidinekinase-tk)基因，来自单纯庖疹病毒（HSV），当它在受体细胞内合成出tk时，可以分解细胞培养液中加入更昔洛韦，即gangcyclovir（一种环鸟苷酸底物)而产生有毒的分解物使细胞死亡，为阴性筛选标志。在特定基因剔除时，利用打靶载体上留下的部分待剔除的基因片段作为基因组上相同基因的同源臂，当打靶载体与细胞基因组的同源基因发生同源重组时（联会），打靶载体上的失活基因替代基因组上的基因，同时利用插入在基因同源臂之间的阳性、阴性标志基因进行筛选鉴定。1231号发生位点同源重组，在G418培养基中生长；2号为随机插入重组，带入tk基因，可在G418培养基中生长，但在gangcyclovir培养基中被杀死；3号未发生任何重组，为正常细胞，在G418培养基中被杀死。抵抗G418的基因tk基因B、制备基因敲除动物（小鼠）1、将发生同源重组的胚胎干细胞导入来自黑色的小鼠胚泡中（形成嵌合体胚胎，两套基因物质）2、将胚泡植入假孕小鼠子宫中发育。3、诞生出杂合的嵌合体小鼠，具黑毛和褐色毛，胚胎干细胞来自褐色小鼠，正常胚胎来自黑色小鼠。4、嵌合体小鼠与野生黑色小鼠交配，产生纯黑色与纯褐色的后代小鼠，其纯褐色小鼠为杂合子，有一目的基因已被敲除。5、近亲交配，产生纯合子基因敲除小鼠（第四代）。打靶载体内切酶消化线性化打靶载体转染基因组同源重组同源重组的胚胎干细胞胚泡植入假孕小鼠杂合子小鼠正常小鼠杂合子小鼠交配杂合子小鼠兄妹交配纯合子小鼠（基因剔除）黑色雌性大鼠来自褐色大鼠B、制备基因敲除动物（小鼠）1、Neor（neomycin-resistancegene)基因：阳性筛选标志，使细胞具有抵抗新霉素（G418）能力。2、胸苷酸激酶(thymidinekinase)的作用：阴性筛选标志，分解底物为gangcyclovir杀死细胞（自杀基因）新霉素抗性基因(neo)是真核表达载体的常用筛选标志,neo基因编码新霉素磷酸转移酶Ⅱ(NPTⅡ),能催化G418、卡那霉素等多种氨基糖苷抗生素分子磷酸化而使之失去抗菌活性G418（也称遗传霉素）是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞都有毒性,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞,也包括原生动物和蠕虫。是稳定转染最常用的选择试剂。当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达,使细胞获得抗性而能在含有Ｇ418的选择性培养基中生长。Ｇ418的这一选择特性,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。小鼠基因敲除发了2005年8月12日的Cell封面文章。这里有一篇当时的中文报道。（三、条件性基因敲除（conditionalgeneknockout）1、概念：基因敲除可在动物（小鼠）的特定时期或特定组织中剔除特定基因，或称条件性组织特异性基因敲除（conditionaltissuespecificgeneknockout）2、基本原理：（1）、制作基因敲出小鼠（同源重组），使该小鼠基因组中的一个待敲除的基因两侧引入Loxp序列，如图待敲除的基因序列Loxp序列，由重组酶Cre识别，并可将绿色目标基因切除。前述操作与常规基因敲除程序相同，如制作打靶载体，含NEO抵抗基因，tk基因，制作基因敲除的胚胎干细胞……….（2）、制作转基因小鼠，使其基因组中含Cre重组酶，并使该基因处于一可被诱导的启动子的下游（如四环素可诱导Cre基因表达…..）（3）、令1,2两种基因改变的小鼠交配，筛选在基因组中两种序列都存在的小鼠后代，如图。（或将Cre重组酶基因再导入小鼠（1），以小鼠（1）为受体动物。5，启动子Cre重组酶基因四环素诱导，基因表达mRNA表达的Cre酶没诱导存在时，该基因不表达，所以可达到在特定时期，特定组织的基因敲除。据悉：北大医学部成功繁育出脂蛋白脂酶（LPL）基因敲除小鼠模型，其血甘油三酯极高，具有自发性动脉粥样硬化倾向。他们又成功的制作了ApoE基因敲除小鼠模型，研究动脉硬化的发病机制。Neomycin-resistancegeneiswidelyusedasaselectablemarkerineukaryoticexpressionvector