经典抗原抗体沉淀反应

经典抗原抗体沉淀反应关键词：样品聚乙二醇聚苯乙烯苯巴比妥庆大霉素试剂标准物质北京标准物质网指可溶性抗原(主要为蛋白类物质)与相应抗体结合后形成肉眼可见的沉淀物的现象。沉淀反应一般在抗原抗体分子可咀自由扩散且彼此接触的固体状琼脂凝胶中进行，抗原抗体在二者比例合适处结合并形成较稳定的白色沉淀线。沉淀反应一般分为单向免疫扩散试验、双向免疫扩散试验、免疫电泳和免疫比浊。免疫扩散试验和免疫电泳均可在琼脂凝胶中形成肉眼可见的沉淀线(或沉淀环)，一般用于对免疫球蛋白、补体等的检测。免疫比浊是在一定量的已知抗体中分别加入递增量的抗原，经一段时间反应后用浊度仪测量抗原抗体沉淀物的浊度，由于浊度与抗原浓度成正比，故可根据浊度推算出样品中的抗原含量。1.单项免疫扩散试验先将一定量的抗体或抗血清(或抗原)均匀地分散于固相琼脂凝胶中，然后加入抗原或待测血清(或抗体)。加入的抗原或待测血清(或抗体)向周围扩散，在抗原与抗体的量达到一定比例时即可形成肉眼可见的沉淀环。在一定条件下，沉淀环的大小与抗原浓度成正相关。用不同浓度的标准抗原制成标准曲线，则被测标本中的抗原含量即可从标准曲线中查出。单向琼脂扩散实验可分为平板法和试管法。平板法是将抗体或抗血清(或抗原或待测血清)与琼脂糖溶液(浓度一般为0.9％左右，温度在50℃至60℃)均匀混合，在凝固前倾注成平板，待琼脂糖溶液完全凝固后用打孔器在琼脂凝胶板上打孔(孔径一般为3mm、孔距为12～15mm，孔要尽可能打得圆整光滑、不要破裂)，将抗原加入孔中，置于37℃让其自然扩散，一般在24～48小时后可见孔周围出现沉淀环，通过测定环的直径或面积可计算标本中待测抗原的浓度。试管法是将一定量的抗体均匀混于50℃至60℃的0．7％琼脂糖溶液中并注入小试管内，待琼脂糖溶液凝固后在上层加抗原溶液，待测抗原在凝胶中自然扩散，在抗原抗体比例恰当处形成沉淀环。试管法较为简单，但平板法因易于定量故更为常用。单向琼脂扩散实验常用于对抗原的检测，使用的抗体或抗血清需具有较高特异性和较强的亲和力。应用单克隆抗体测量多态性抗原时，测定值易于偏低：反之用多克隆抗体测量单克隆病时(即单分子改变性疾病)，测定值易于偏高。琼脂质量、浓度、加样孔大小、加入抗体时琼脂糖溶液的温度及抗体是否与琼脂糖溶液充分混匀等对结果均有较大影响，需予以注意。同时每次测定都必须做标准曲线，要用质控血清对实验进行质控。2.双向琼脂扩散试验把可溶性抗原和抗体分别加在含有电解质的同一块琼脂糖凝胶板的对应孔中，它们在向凝胶四周扩散过程中，如果抗原和抗体相遇二者呈特异性结合且比例适当时，将会形成抗原抗体复合物的沉淀，该沉淀可在琼脂中呈现一条不透明的白色沉淀线。如果抗原与抗体无关，则不会出现沉淀线。因此，可以通过该试验用特异性抗体鉴定抗原，反之也可以用己知抗原鉴定抗体。双向琼脂扩散试验属于定性实验，简单易行，常用于抗原抗体的纯度鉴定、抗血清效价的初步判断及抗原或抗体的检测。沉淀线出现的时间、位置及形状特征与抗原抗体浓度、纯度等有关。双向琼脂扩散试验沉淀线一般在24小时内可出现，如抗原抗体浓度较低，沉淀线出现时间较晚，如96小时仍无沉淀线出现，可视为反应阴性。如沉淀线不在两对应孔的中间，说明离沉淀线较近一侧孔内的抗体或抗原浓度相对较低。若相邻两条沉淀线完全相连呈弧线状，说明此两孔内抗原完全相同；若相邻两条沉淀线呈直线状交叉而过，说明此两孔抗原完全不同；若两条沉淀线部分相连且呈毛刺状，说明此两孔内抗原有部分是相同的。观察沉淀线的出现时间要适当，观察过早沉淀线可能还未出现，而过迟可能会使已形成的沉淀线解离或散开而影响观察。另外，制作的琼脂糖凝胶板最好能马上使用，如保存过久(超过48小时)可因水分蒸发使凝胶浓度发生变化等，可使沉淀线的位置及线条模糊不清；加样孔混有气泡使溶液溢出孔外、或加样孔发生孔底流溢等，对沉淀线的形成时间和形态也均有较大影响，应尽量避免。3.免疫电泳是将凝胶内的沉淀反应与蛋白质电泳技术相结合的一种免疫检测方法。沉淀反应依靠的是抗原抗体在凝胶中的自由扩散，而免疫电泳则通过直流电场作用，使带电荷的抗原与抗体向异相电荷的电极快速泳动，即在凝胶中快速定向扩散，加快了沉淀现象的产生。根据沉淀线(环)的有无，判断样品中有无与诊断抗体(或抗原)对应的抗原(或抗体)。与沉淀反应相比，免疫电泳技术具有灵敏度高、分辨力强、反应快速等特点，常用于对抗原抗体的检测或抗原的纯度分析。由于免疫电泳是带电荷的抗原、抗体在电场中的定向泳动，故抗原或抗体所带静电荷量、分子量及分子形状等均与泳动速度有关，静电荷量越多，分子或颗粒越小，电泳速度越快，反之越慢。不同蛋白往往带有不同电荷，当有多种蛋白抗原存在时，由于静电荷量不同而导致其电泳速度不同，从而可以形成不同的抗原抗体复合物区带。除抗原抗体的特性外，电场因素如电场强度、溶液pH、离子强度等，也是免疫电泳的主要影响因素。免疫电泳可根据抗原抗体的双向或仅为抗原的单向扩散及抗原抗体反应条带显示方法等的不同，可分为对流免疫电泳、火箭免疫电泳、免疫固定电泳和交叉免疫电泳等，各有优劣势，具体应用可参考有关专著。4.免疫比浊法是抗原抗体结合的动态测定方法。测定原理是当抗原与抗体在特殊稀释系统中反应而又比例合适时(一般需抗体过量)，形成的可溶性免疫复合物在稀释系统中的促聚剂(如聚乙二醇等)的作用下，自液相析出形成微粒，使反应液出现浑浊(浊度)。当在检测系统中固定抗体浓度时，免疫复合物的形成量会随着受检样品中抗原量的增加而增加，表现为反应液的浊度也随之增加。将反应液浊度与一系列已知抗原含量标准品的浊度进行比较，即可计算出受检样品抗原的含量。常用免疫比浊法可分为透射比浊法、散射比浊法、免疫胶乳比浊法和速率抑制免疫比浊法等。免疫透射比浊法利用光线通过溶液时，可被溶液中的免疫复合物吸收，光线被吸收的量在一定范围内与免疫复合物的量成正比这一原理，用比浊计测定光密度值，复合物的含量与光密度值成正比。当抗体量一定时，光密度值也与抗原含量成正比。散射比浊法利用一定波长的光沿水平轴照射通过溶液时，溶液中的抗原抗体复合物颗粒使光线被折射而发生偏转，偏转的角度与抗原抗体复合物颗粒大小相关的原理，用于抗原的检测。溶液中待测抗原越多，形成的复合物也越多，散射光也越强。免疫胶乳比浊法是将待测物质相对应的抗体包被在直径为15～60nm的胶乳颗粒上(常用聚苯乙烯)，增大的抗原抗体复合物颗粒使光通过之后的透射光和散射光强度变化更为显著，进而提高实验的敏感性。速率抑制免疫比浊法常用于体液中半抗原(如苯巴比妥、庆大霉素等药物)的测定，反应体系中含有载体，半抗原复合物及以此免疫获得的抗血清。当加入样品中含有半抗原时，它能与载体．半抗原复合物竞争抗体结合位置，从而使载体，半抗原复合物与抗体形成的速率峰值降低，降低的程度与半抗原的量成正比，由此可算出检测样品中半抗原的含量。在进行免疫比浊测定时，应维持反应体系中抗体过量；对试剂(包括待测血清)在用前最好能3000r／min离心20分钟，以避免其他无关颗粒物的干扰。