A549细胞培养

A549细胞的培养A549细胞为人肺腺癌细胞，属于传代细胞系，可稳定地传代培养。一般用胰酶消化后，加入生长液稀释，以1：2～1：3传代培养都是可行的。一、[所需溶液]1，细胞冲洗液：磷酸盐缓冲液(PBS)——无Ca、MgNACL8.00g；KCL0.20g;KH2PO40.20g;Na2HPO4.。12H2O1.15g加水至1000mL,将PH调至7.4，高压灭菌。2，消化液（1）胰酶-PBS结晶胰酶2.5g;高压灭菌后的PBS1000ml用磁力搅拌器搅拌均匀，使其完全溶解，通过0.22μm的滤膜过滤除菌，分装备用，放置—20℃保存。（2）胰酶—EDTA:结晶胰酶0.5g;EDTA盐溶液0.2g无Ca、MgPBS1000ml用磁力搅拌器搅拌均匀，使其完全溶解，通过0.22μm的滤膜过滤除菌，分装备用，放置—20℃保存。3，细胞培养液：RPMI1640培养液配制方法：（1）将一袋干粉型RPMI1640培养基溶于900ml三蒸水中，冲洗包装袋两至三次倒入培养液中。（2）加入丙酮酸钠0.1g，NaHCO22g以及双抗，加入磁力搅棒并置于磁力搅拌器上充分搅拌。双抗的配置浓度为100U/ML青霉素和100U/ML链霉素。(一般市售的青霉素为80万U/瓶，将其溶解于4ml三蒸水中，每升培养液中加入0.5ml；市售的链霉素为100万U/瓶，将其溶解于5ml三蒸水中，每升培养液中加入0.5ml)。（3）调整培养液的ＰＨ值，用ＰＨ精密试纸观察ＰＨ７.２～７.４即可。（4）过滤法除菌，所使用的滤器为Ｏ２加压过滤，０.２２μｍ滤膜，滤膜事先采用高压灭菌消毒。（5）分装，加盖瓶塞，加封纱布报纸，用绳固定，放置—20℃保存。二、［细胞的维持和培养］１，细胞的复苏（１）准备一个盛有３７℃温水的烧杯，从液氮罐中取出存有Ａ５４９细胞的冻存管，放于３７℃温水中，用镊子夹住轻轻摇动使其迅速融化。（２）1000～２000r，3～５min离心。（３）在无菌操作台中采用75%的乙醇彻底擦拭冻存管，然后打开冻存管，注意动作要轻柔。（４）用1ml枪头将上清液去除，加入1ml预热的细胞培养液将细胞吹散开，转移至25cm2培养瓶中。（５）补充4ml的RPMI1640培养基，并且添加10%的胎牛血清。（６）倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2培养。（７）24h后，更换新的培养液。（８）常规传代培养。２，A549细胞更换新的培养液（１）无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。（２）用PBS反复冲洗细胞2～3遍。（３）加入新鲜的预热好的培养液及10%的胎牛血清。各种液体需要量（ml）表面积25cm275cm2150cm2洗涤3510胰酶1～21～32～5培养液51020（４）倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2培养。３，A549细胞的传代（１）无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。（２）向已经长满的细胞中加入消化液1ml，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有的细胞表面，吸弃或倒掉，轻轻冲洗细胞表面2～３遍，以尽可能去除原培养液中的牛血清。（３）加入1ml消化液，在37℃培养箱中孵育5～８min后把培养瓶放置在倒置显微镜下观察，发现细胞的胞质回缩、胞间质增大后，立即终止消化。（４）加入5ml预热至37℃的培养液，用玻璃吸管反复吹打以分散细胞。吹打过程按顺序进行，从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有的底部都被吹到。（５）吸取一半的细胞悬液，接种到新的25cm2培养瓶中，补足培养液，并且添加10%～20%的胎牛血清。通常每瓶液体量为5～10ml。（６）倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2培养。注意事项：（１）所有液体在加入细胞瓶前均应预热到37℃。所有液体均应调整PH至7.2左右，均不能超过7.4。（２）细胞消化传代时吹打不要产生气泡，吹打力量不宜过多，否则会损伤细胞。（３）严格执行无菌操作的要求。（４）尽可能减少消化液剩余量，过多时会对细胞产生损伤，可多添加些含牛血清的培养液中和。（５）培养瓶在室温中放置时间应尽可能短。４，A549细胞的冻存（１）消化已生长融合的单层细胞。（２）用生长液悬浮细胞，并且添加10%的FCS和10%DMSO(二甲基亚砜)。分装在2ml容积的冻存管中。（３）用本实验室自制的冻存包包裹好冻存管，放在-70℃冰箱中过夜。（４）放入液氮中冻存。