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微量肉汤稀释法药敏检测以下实验方法主要适用于需氧菌及部分兼性厌氧菌（以大肠杆菌为例），微需养菌和厌氧菌的培养条件亟待摸索。本实验方法，虽然操作较为繁琐，但是能够确切的得到细菌临床分离株对某种抗菌药物的MIC值，以此作为临床用药指导的部分依据。菌悬液的制备：①菌液培养：取待测菌保存液10µL加入1mLMH肉汤（可根据实际需要做调整），置37℃温箱过夜静止培养12小时左右；②OD600值测定：利用紫外分光光度仪测定OD值，MH肉汤调整菌液浓度使其OD600值落在0.08-0.1之间，此时菌液浓度约108cfu/mL（大约需将培养菌液稀释7-10倍左右）；③上样菌液稀释：将待测菌液在步骤②所得稀释倍数的基础上再稀释1000倍，此时菌液浓度约105cfu/mL（即7000-10,000倍），此时的菌液即为上样菌悬液；注意：测定OD值所需菌液应在超净台中无菌取样，剩余菌液还需实验。抗菌药物的制备：抗生素母液配制：参照NCCLS标准上抗菌药物相应的R（抗药）值制备待测抗菌药物（母液浓度要远远大于R值，至少160倍），分装于无菌小管置-20℃备用（附件一.常用抗生素溶液的配制）。注意：无菌操作，抗菌药物的稀释液均需灭菌，溶解后还应过滤（滤膜孔径为0.22µm）药敏试验的操作：①将待测抗菌药物进行10倍稀释；②无菌96孔板第1-11列加入灭菌MH肉汤100µL（一药一板）；③无菌96孔板第1列加入10倍稀释的药液100µL，逐次倍比稀释至第11列（每孔液体终体积是100µL）；④无菌96孔板的每一孔加入待测菌液100µL，每孔液体终体积是200µL（由于整板都是一种药物，所以96孔板的每一行可进行一种细菌的药敏试验，为了保证实验的可靠性，每株菌进行一次重复，即一株菌做两行，一块板可做四株细菌的药敏试验）；⑤无菌96孔板的第12列上4孔加入200µL/孔灭菌MH肉汤作为阴性对照，第12列下4孔加入200µL/孔菌液（四株菌的菌液）作为阳性对照；⑥药物和菌液上样完毕后，盖好板盖，置37℃温箱培养18-22小时观察结果（结果的判读请参照附件二.2009年NCCLS抗菌药物敏感性试验解释标准）。注意：无菌操作。96点阵法药敏检测（大通量的药物敏感性检测实验）以下实验方法主要适用于需氧菌及部分兼性厌氧菌（以大肠杆菌为例），微需养菌和厌氧菌的培养条件亟待摸索。该方法能够快速得到某种抗菌药物对细菌临床分离株的作用，抗药还是敏感，以此作为临床用药指导的部分依据。菌悬液的制备：①菌液培养：无菌96孔板培养96株待测菌株（每一孔对应一株菌），每孔含有灭菌MH肉汤200µL，待测菌株保存液5µL，置37℃温箱过夜静止培养12小时左右；②上样菌液稀释：将过夜培养所得菌液稀释1000倍（使用无菌96孔板分三次进行稀释，每次稀释10倍，最后一次稀释所得菌液即为上样菌悬液）；抗菌药物的制备：抗生素母液配制：参照NCCLS标准上抗菌药物相应的R（抗药）值制备待测抗菌药物（母液浓度要远远大于R值，至少100倍），分装于无菌小管置-20℃备用（附件一.常用抗生素溶液的配制）。药敏试验的操作：①用本实验室新定制的细菌培养瓶配制MH固体培养基，定量35mL，灭菌；②待MH固体培养基灭菌完毕，温度降至45℃左右时，加入一定量的抗菌药物，使其终浓度为R值（R值的确定请参照附件二.2009年NCCLS抗菌药物敏感性试验解释标准），混匀，倒入96点阵药敏检测板底座内，用预先灭好菌的96孔板盖进行加盖；③用灭好菌的96点阵药敏检测板的锥体盖对应蘸取96孔板内已稀释好的上样菌悬液，轻轻盖在96点阵药敏检测板底座的药物培养基对应位置上；④置37℃温箱培养18-22小时观察结果。如果锥体接触的培养基位置长菌，说明该菌对板内药物抗药；如果不长菌，说明该菌对板内药物敏感。注意：①在倾倒培养基时，务必确保三个无菌，96点阵药敏检测板的底座、锥体盖及96孔板盖无菌。此外，操作时，请勿将手随便在培养基表面晃动，及时盖盖；②往培养基中加抗生素时，一定控制好培养基的温度，温度过高，药物会失效；温度过低，培养基会凝固，药物混合不均匀。纸片扩散法药敏检测以下实验方法主要适用于需氧菌及部分兼性厌氧菌（以大肠杆菌为例），微需养菌和厌氧菌的培养条件亟待摸索。该方法能够快速、准确地得到某种抗菌药物对细菌临床分离株的作用，抗药还是敏感，以此作为临床用药指导的部分依据。菌悬液的制备：①菌液培养：取待测菌保存液10µL加入1mLMH肉汤（根据实际需要可做调整），置37℃温箱过夜静止培养12小时左右；②用无菌生理盐水，对照0.5麦氏比浊管矫正菌液浓度；抗菌药物纸片和培养基的制备：①抗菌药物纸片可以从试剂公司直接购买，杭州天和等多家试剂公司均售（国产和进口）；②将灭菌MH固体培养基倒入无菌平板中，9cm平板中培养基高度约4cm；药敏试验的操作：①用无菌棉拭子蘸取菌液，在管内壁将多余菌液旋转挤去后，在培养基表面均匀涂抹3次，每次60°，最后沿平板内缘涂抹一周；②平板置室温下干燥3-5分钟，用无菌镊子将药物纸片小心紧贴于培养基表面，各纸片中心相距24mm，纸片距平板内缘15mm，纸片贴上后不可再移动；③置37℃温箱培养16-18小时观察结果（结果的判读请参照附件二.2009年NCCLS抗菌药物敏感性试验解释标准）。注意：①在涂抹菌悬液时，保证培养基表面干燥无水；②在贴药敏纸片时，一定要稳、准，不能在培养基表面来回移动，水平放置，轻轻按压即可；③药敏制片相聚不能太近，否则会影响结果的判读。牛津杯法药敏检测牛津杯是药学和理学实验室中常用的基础实验器材，用牛津杯法做抑菌试验要注意以下几点事项：①首先要把平板倒好，一定要平，才能保证杯内抑菌物质均匀地向四周扩散；②不要封口，常用的生物法测定抗生素采用杯碟法，“杯”是放被测抗生素的不锈钢小管，小管内径6nm，高10nm的圆筒形管子，管子重量尽可能相等，碟是摊布培养基的玻璃培养皿。药敏试验操作方法（一）：①将已灭菌的琼脂培养基加热至完全融化，倒在培养皿内，每碟15mL（下层），待其凝固；②将融化的培养及冷却到50℃左右混入试验菌，将混有菌的培养基5mL加到已经凝固的培养基上待其凝固（上层）。③在培养基表面垂直放上小杯，杯中加入待检样品，加满后在37℃培养16-18小时。培养中，一方面试验菌开始生长，另一方面抗生素成球面扩散，离杯越近，抗生素浓度越大，离杯越远抗生素浓度越小。随着抗生素浓度减小，有一条是最低抑菌浓度带，在带范围内，细菌不能生长，而呈透明的圆圈，这就叫“抑菌圈”，抗生素浓度越高，抑菌圈越大。药敏试验方法（二）：①在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。（另：可挑取待试细菌于少量生理盐水，对照0.5麦氏比浊管矫正菌液浓度制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密；②以无菌操作将灭菌的不锈钢小管（内径6nm、外径8nm、高10nm的圆形小管，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培养基上，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，并在小管处标记各种药物名称。每个平板可放4-6支小管。待放好后，分别向各小管中滴加一定数量的待测抗菌药物药液，勿使其外溢。置37℃培养8-18小时，观察结果。③将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。联合法药敏检测体外联合药敏试验的目的在于：①扩大抗菌谱，治疗混合感染；②预防或推迟细菌抗药性的发生；③联合用药还可以计量以避免达到毒性剂量；④对某些抗药细菌引起的严重感染，联合用药比单一用药时效果更好。抗菌药物联合应用可出现以下4种结果：①无关作用，两种药物联合作用的活性等于其单独活性；②拮抗作用，两种药物联合作用显著低于单独抗菌活性；③相加作用，两种药物联合作用的活性等于两种单独抗菌活性之和；④协同作用，两种药物联合作用显著大于其单独作用的总和。药敏试验方法：棋盘稀释法是目前临床试验时常用的定量方法，利用肉汤稀释法原理，首先分别测定拟联合的抗菌药物对待测菌的MIC。根据所得MIC，确定药物稀释度（一般为6-8个稀释度），药物最高浓度为其MIC的2倍（即2MIC），依次对比稀释。两种药物的稀释分别在方阵的横列和纵裂，这样在每管（孔）中可得到不同浓度组合的两种药物混合液。接种菌量为5×105CUF/ml，37℃孵育18-24小时后观察结果。计算部分抑菌浓度指数（fractionalinhibitoryconcentration，FIC）指数。计算公式及判定标准：注意：混合药液的稀释是很麻烦的一项操作，一定要细心！混合药液的稀释，可沿对角线依次倍比稀释！附件一.抗菌药物贮备液制备用溶剂和稀释剂抗菌剂溶剂稀释剂阿米卡星Amikacin水阿莫西林Amoxicillin磷酸缓冲液pH6.0,0.1mol/L磷酸缓冲液pH6.0,0.1mol/L氨苄西林Ampicillin磷酸缓冲液pH8.0,0.1mol/L磷酸缓冲液pH6.0,0.1mol/L安普霉素Apramycin95%乙醇水阿奇霉素Azithromycin95%乙醇或冰乙酸肉汤培养基头孢唑啉cefazolin磷酸缓冲液PH6.0,0.1mol/L磷酸缓冲液PH6.0,0.1mol/L头孢噻呋Ceftiofur水或肉汤水或肉汤头孢噻吩Cephalothin磷酸缓冲液pH6.0,0.1mol/L水头孢氨苄cephalexin磷酸缓冲液PH6.0,0.1mol/L水氯霉素Chloramphenicol95%乙醇水环丙沙星Ciprofloxacin水克拉维酸Clavulanicacid磷酸缓冲液pH6.0,0.1mol/L磷酸缓冲液pH6.0,0.1mol/L克林霉素Clindamycin水硫酸黏菌素Colistina水水达氟沙星danofloxacin1/2体积水，逐滴加入1mol/LNaoH至溶解水二氟沙星difloxacin1/2体积水，逐滴加入1mol/LNaoH至溶解水强力霉素doxycycline水恩诺沙星enrofloxacin1/2体积水，逐滴加入1mol/LNaoH至溶解水红霉素erythromycin95%乙醇或冰乙酸水氟苯尼考florfenicol95%乙醇水氟甲喹flumequine1/2体积水，逐滴加入1mol/LNaoH至溶解水庆大霉素Gentamicin水卡那霉素Kanamycin水左氧氟沙星levofloxacin1/2体积水，逐滴加入0.1mol/LNaoH至溶解水麻保沙星marbofloxacin1/2体积水，逐滴加入1mol/LNaoH至溶解水甲氧西林methicillin水萘啶酸Nalidixicacld1/2体积水，逐滴加入1mol/LNaoH至溶解呋喃妥因nitrolurantoinc磷酸缓冲液pH8.0,0.1mol/L磷酸缓冲液pH8.0,0.1mol/L诺氟沙星Norfloxacln1/2体积水，逐滴加入0.1mol/LNaoH至溶解水新生霉素novobiocin水氧氟沙星ofloxacin1/2体积水，逐滴加入0.1mol/LNaoH至溶解水苯唑西林oxacillin水土霉素oxytetracycline100%甲醇水青霉素penicillin水吡利霉素pirlmycin水多粘霉素BPolymywinB水水利福平Rifampin甲醇[最大浓度640µg/mL]水(搅拌)大观霉素Spectinomycin水链霉素Streptomycin水磺胺Sulfonamides1/2体积热水,以最小量的2.5mol/LNaOH溶解水四环素Tetracycline水替米考星Tilmicosin95%乙醇水甲氧苄啶Trimethoprim0.05mol/L乳酸或盐酸,加入量为终浓度水（可能需要加热）万古霉素Vancomycin水注意：药物不全，可以逐步补充！磷酸盐缓冲液的配制母液：A：0.2mol/L