HRM

HRM与常规熔解曲线的区别HRM的概念早在上世纪70年代就已经提出并应用于相关的研究中。限于当时有限的实验条件，人们通过紫外吸收来绘制熔解曲线，当然这种方法在检测精度上相比现在的研究手段要大打折扣。随着仪器的改良和定量PCR技术的出现，人们开始用SybrGreenI荧光染料在在定量PCR仪上监测熔解曲线的变化，这也是现今使用最多的熔解曲线研究工具。然而限于分辨率的关系，SybrGreenI熔解曲线一般用于区分在片段大小和GC含量上差别较显著的DNA序列，例如用于检查PCR扩增产物中是否存在引物二聚体及其它非特异性的扩增。如果要用SybrGreenI熔解曲线来区分SNP，目前看来是无法实现的，这与该类染料的特性相关。SybrGreenI这类染料属于非饱和性染料，由于染料对PCR的抑制作用，在实验中的使用浓度很低，远低于将DNA双螺旋结构中的小沟饱和的浓度，由于使用浓度未达到饱和，加之染料本身的特性，在DNA双链解链的过程中，SybrGreenI分子发生重排，那些从已经解链的DNA片段上脱离下来的染料分子又与尚未解链的双链DNA结合，造成结果失真，无法真实反映DNA熔解的情况，影响了检测的分辨率。近几年来，人们发现/发明了一类新型的染料，称为饱和染料，如LCGreen，LCGreenPlus，SYTO9和EvaGreen。这类染料有着更强的DNA结合能力和很低的抑制作用，在DNA解链过程中不会发生重排，这使得用这些染料的熔解曲线有了更高的分辨率。在仪器精密度提高的基础上，配合这类饱和染料就出现了我们现在所说的高分辨率熔解曲线，即HRM。这样人们便可以利用熔解曲线分析这种极其简单的实验手段来对SNP和突变进行研究了。五、LightScanner高分辨溶解曲线应用1、应用一：未知SNP扫描（MutationDiscovery）LightScanner直接检测PCR产物可以发现序列中是否有未知的SNP图一：设计引物，扩增目的片段（一般为100～400bp大小），在PCR之前掺入LCGreen荧光染料（图一左），针对扩增的目的片段进行HRM分析，可找出新的未知SNP（图一右）。2、应用二：已知SNP位点基因分型（Genotyping）方法一;SmallAmplicon法进行已知SNP位点基因分型图二：针对已知SNP位点设计小片段（一般片段大小50～100bp），PCR前掺入LCGreen荧光染料，对PCR产物进行HRM检测，采用SmallAmplicon分析，可以给出该SNP位点的3种基因型。方法二：LunaProbe（非标记探针）法进行已知SNP位点基因分型图三：针对已知SNP位点设计20～35bpLunaProbe（非标记探针，与普通引物价格相当），PCR前掺入LCGreen荧光染料，针对PCR产物进行HRM检测，采用LunaProbe分析，可以给出该SNP位点的3种基因型。