酶标仪光路基础

BioTekUniversityOurPeople,OurCustomers,OurProducts,OurProcesses美国伯腾仪器有限公司市场部王凯光路径长度校正（PathlengthCorrection）假定在微孔板中放有水中溶解的DNA溶液:尽管水不是染料，水在977nm有一个吸收峰水在标准的1cm比色杯中，977–900nm吸光度是0.18OD菌液在600nm有一个吸收峰菌液计算溶液的光路径长度,先测量977–900nm(作为参照)吸光度数值，并和water@1cm的OD相比:A977-A900sample/0.18OD=样品光路径(incm)利用计算出的光路径长度和测量的600nm吸光度，计算出1cm标准光路径长度下的吸光度:A600sample–A600blank/SamplePathlength=ODcorrectedto1cmBioTek简介专业的微孔板相关仪器厂家–微孔板检测仪器•吸收光酶标仪•荧光酶标仪•发光酶标仪•多功能酶标仪–洗板机–移液及分液系统–自动化系统BioTek产品线介绍专业性Since1968GetaBetterReactionBetterProductDesignBetterCustomerServiceBetterQualityControl为客户提供最好的产品和服务！ApplicationsELISA–EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay–HIV,Measles,BloodType,E.Coli,etc.GeneExpressionAssays–whatfunctiondoesagenehave?CellProliferation–whatmakescellsgrow?CellToxicity–cellulardeath?DNAQuantitation–howmuch?DNAPurity–howgood?EnzymeActivity–catalysttoreaction.DrugScreening–isadrugactive?吸收光Absorbance硬件要求光源分光设备检测元件OpticsMicroplateDATA卤钨灯+滤光片滤光片系统的吸收光检测ELx808震荡ELx800无温控，震荡ELx808IU温控，震荡ELx800UVELx808NBAbsorbanceLPXenonFlashLamp-AllowingexpandedWavelengthRange1002505007501100e200nm999nm~PathlengthCorrection-AllowingparitywithSpectrophotometers1cm??Monochromator-AllowingSelectableWavelengthAbsorbance–OpticalSystemXenonFlashLampOrderSortingFiltersDiffractionGratingFiberOpticMicroplateLensPhotodiodeReferencePhotodiodeDataDataMonochromatorbasedAbsorbancereaderEpochEon吸收光应用，主流酶标仪光路光源：氙灯波长选择单色器vs滤光片带宽为何采用单色器单色器–200-999nm间任意选择波长，无需滤光片！–可进行光谱扫描，寻找吸收峰–可以将带宽控制在2.4nm，提高吸收光检测的特异性–红外区域可以做光路径长度校正Beer’sLaw:OD=(extinctioncoefficient)*(concentration)*pathlength=?cm孔内装有200µlDNA溶液，高度是多少？=?cm孔内装有100µlDNA溶液，高度是多少？光路径长度校正（PathlengthCorrection）我们知道，在260nm和1cm光路经下，1O.D.的DNA溶液的DNA浓度是50µg/ml1cm光路径是一个标准.消光系数在光吸收的时候与底物的浓度成正比.Beer’sLaw:OD=(消光系数)*(concentration)*光路径长度不需要做标准曲线光路径校正的最大应用在直接在微孔板里对核酸进行定量，与研究者在分光光度计里用比色杯做的结果一样.DNA1O.D.=50µg/ml但是在微孔板里，由于液体体积的不同造成的液面高度不同。由于测量光路是垂直的，所以光路径长度也是不同的，这样的话直接进行DNA定量就很困难。在标准的比色杯里，直接对DNA溶液中的核酸进行定量是比较容易的，例如:1.0O.D.*50µg/=ml=50µg/mlofDNA2.0O.D.*50µg/ml=100µg/mlofDNA2.5O.D.*50µg/ml=125µg/mlofDNA如果光路径长度未知，直接对每孔的DNA进行定量几乎是不可能的.光路径长度校正（PathlengthCorrection）=?cm含有200µlDNA溶液的微孔板.每个孔溶液的光路径是多少？?=?cm含有100µlDNA溶液的微孔板.每个孔溶液的光路径是多少？?光路径长度校正（PathlengthCorrection）我们如何换算微孔板的光路径长度?可以选用一种已知染料溶剂，在固定光路径长度（1cm）下有已知光吸收.例如:200µl黄色染料溶液在450nm数值为0.750O.D.同样的染料溶液在450nm，1cm比色杯中的数值为1.200O.D.0.750OD1.200OD微孔板中的溶液光路径长度可以计算出:0.750/1.200or0.625cm光路径长度校正（PathlengthCorrection）假定在微孔板中放有水中溶解的DNA溶液:尽管水不是染料，水在977nm有一个吸收峰水在标准的1cm比色杯中，977–900nm吸光度是0.18ODDNA在260nm有一个吸收峰DNA计算溶液的光路径长度,先测量977–900nm(作为参照)吸光度数值，并和water@1cm的OD相比:A977-A900sample/0.18OD=样品光路径(incm)利用计算出的光路径长度和测量的260nm吸光度，计算出1cm标准光路径长度下的吸光度:A260sample–A260blank/SamplePathlength=ODcorrectedto1cm最后,计算出每孔的DNA浓度:O.D.correctedto1cm*50=Conc.OfDNAinthewell(inµg/ml)光路径长度校正（PathlengthCorrection）举例:微孔板中未知高度DNA水溶液.在Gen5软件中操作，读取977,900and260nm的吸光度,选择光路径长度校正.数据回归:977–900measurement=0.113OD260–blank=1.500OD1.计算光路径长度:0.113/0.18OD=0.6278cm2.换算吸光度:1.500/0.6278=2.389OD3.计算出DNA浓度:2.389*50=119.45µg/mlSlit200-999nmPhotodiodeReferenceXenonFlashBioTek：基于单色器的吸收光2.4nm的单色器吸收光路，可以运行200-1000nm的任何吸收光实验超静氙灯，信号稳定，CV值小Take3板双排孔设计，间距同96孔板不锈钢顶部设计上部玻片嵌入石英板外覆特氟龙，检测点直径2mm两块玻片由吸铁吸附，易于更换BioCell位置标准比色杯位置通过合页开合进行样品检测-2mm--2mm--2mm-2µl2µl2µl0.5mmnominal-2mm--2mm--2mm--2mm--2mm--2mm-Take3板光路Take3板加样荧光Detection:FluorescencereadersFluorescenceisusedwhenhighsensitivityisrequiredAlightbeamilluminatesthesamples(excitationlight)Ifthesampleisfluorescent,it“glows”(emissionlight)andthereadermeasuresthislightLabeledDNAmoleculeExcitationbeam(blue)excitesthelabelLabelemitsredglow,measuredbythereaderFLx800fluorescencereaderFiltersvs.Monochromators:TechnicaldifferencesInterferencefiltersDiffractiongratingInterferencefiltersThewidthofthecavitydefinesthewavelengththatgoesthroughMultiplecavitiesareusedtoprovidesharpcut-offedgesVeryefficient:up80%oftargetwavelengthgoesthroughUsedforthedesignofexcitationandemissionfiltersaswellasdichroicmirrorsReflectivesurfaceswithloworhighrefractiveindexesCavitywidth=½desiredwavelengthExcitationfilterselectsexcitationwavelength.Typicalbandpassisfrom10nmto50nm.Emissionfilterisolatessignalfromsample.Typicalbandpassisfrom5nmto100nm.Dichroicmirrordirectslighttowardssampleandenhancesoverallperformance.InterferencefiltersExcitationFromlightsource100Excitationfilter80%80Dichroic100%80Emission80Dichroic90%72Emissionfilter80%57If1“unitofexcitation”generates1“unitofemission”:Thisverysimpleexampleignoreslightlossesduetolenses,fibers,overallcollectionefficiency.InterferencefiltersGratingsIncidentbeam“0”order1storderspectrum3rdorder(notshown)2ndorderspectrumEnergyat1wavelength(e.g.485nm)issplitbetweenthedifferentorders:0order(reflection),1st,2nd,3rd,…ordersCut-offfiltersareusedtoremovestraylightfromhigherordersAnexitslitisusedtoselectthewavelengthofinterestExitslitөChangingthegrating’sanglefavorsagivenWLrangeExcitationgratingstypicallyhaveaUV-blueblazeEmissiongratingstypicallyhaveayellow-redblazeAverageefficiencyis50%GratingsGratingwith250nmblazeGratingwith750nmblaze500100015002500nm050%100%Effi