EGFR突变检测方法简介

-1-EGFR突变检测方法简介朱冠山(Mike)阿斯利康中国创新研究中心20010年4月9日-2-内容非小细胞肺癌中EGFR活性增强突变标本因素对肿瘤组织中基因突变检测的影响EGFR突变检测方法概述ARMS试剂盒检测EGFR突变工作流程与质量控制-3-NatureReview2007,7:169非小细胞肺癌中EGFR酪氨酸激酶区突变-4-EGFR突变类型与吉非替尼敏感性组别突变类型所占比例对吉非替尼敏感性1Exon19deletions;L858R~90%敏感2T790M/deletion;T790M/L858R;G719X;L861Q;S768I~7%有限敏感3T790Malone;Exon20insertions;othermutations~3%不敏感Moketal.,2008Kimetal.,2008Hirschetal.,2006AZIn-HouseData-Unpublished-5-标本因素对肿瘤组织中基因突变检测的影响--肿瘤组织特点--遗传异质性（Heterogeneity）对检测方法敏感度有较高要求-6-正常细胞混杂（Contaminationwithnormalcells）冰冻组织固定包埋组织--外科手术标本--穿刺活检测标本--外科手术标本--穿刺活检测标本标本因素对肿瘤组织中基因突变检测的影响--组织标本种类--对检测方法敏感度有较高要求-7-EGFR突变检测方法概述直接测序法PCR-RFLP/AS-PCRdHPLC/HRMA实时荧光定量PCR--TaqMan--PNA-LNAclamp--ARMS-8-直接测序法PCR/巢式PCR/突变富集PCR纯化测序反应测序仪毛细管电泳纯化数据分析EGFRdeletionEGFRL858R-9-PCR-RFLP/AS-PCRPCR（荧光标记引物）RFLP毛细管电泳纯化PCR凝胶电泳数据分析AS-PCR特异性测试敏感性测试(fromClinicaChimicaActa;401:68-10-dHPLC/HRMA异源双链形成dHPLC/HRMAdHPLCHRMAPCR/巢式PCR/突变富集PCR(fromDr.WanggroupinBTH)(fromAmJClinPathol;126:608)50%25%12.5%6.25%3.125%1.6%DeletionL858R-11-实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR数据分析TaqManPNA-LNAclampARMSAMutantDNAFPRPGwildDNARPFPFluorescentsignalTaqManassayPNA-LNAclampAmplificationDetection(fromCancerRes;65:7276)-12-方法敏感度直接测序法10-20％PCR-RFLP/AS-PCRN/AdHPLC/HRMA3-12％实时荧光定量PCR--TaqMan10％--PNA-LNAclamp1％--ARMS1％EGFR突变检测主要方法及敏感度-13-测序法与ARMS法比较测序法ARMS敏感度10-20%1%FFPE标本成功率低高商用试剂盒无有流程与速度复杂/慢简单/快数据分析要求高低试剂成本低略高仪器成本高低-14-ARMS方法ARMS基本原理操作流程及数据解读两种商品ARMS试剂盒两种ARMS突变判读与对比-15-ARMS基本原理等位基因特异性PCR+荧光探针=ARMS方法A突变DNA模板突变正向引物延伸反向引物G野生DNA模板突变正向引物无延伸反向引物产生荧光信号-16-DNAARMS反应实时定量PCR操作流程及数据解读数据分析内参信号(HEX)突变:+-内参:++标本＃1标本＃2突变信号(FAM)-17-DxSARMS与ADxARMSDxSARMSADxARMS生产厂商英国DxS公司中国厦门艾德引物与探针设计蝎形引物与探针双环引物与探针检测突变种类29种29种突变判读FAM信号,ΔCt值FAM信号,Ct值DNA用量20ng/Rnx10ng/Rnx适用qPCR机型StratageneMx系列,ABI系列StratageneMx系列,ABI系列,Lightcycler480-18-ΔCt窗口野生型非特异扩增对照反应突变反应突变判读DxSARMSADxARMS突变反应-19-ConclusiononvalidationofADxARMSvsDxSARMS-20-工作流程与质量控制标本种类标本量SOPOD260/280QPCRSOP阳性及阴性对照问题及解决SOP判读标准报告形式及检查标本准备DNA抽提与质控突变检测分析与报告病理评估-21-Q&A