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荧光：1．荧光产生的机理是什么？P233（一）荧光的产生(1)分子的能量状态在光学分析中涉及的分子能级：Eo=Ee+Ev+ErEe：价电子运动能（电子能级）,electronEv：原子在平衡位置附近的振动（震动能级）,vibrationEr：分子绕其重心的转动能（转动能级）,rotation其中EeEvEr(2)分子的能级EnergyLevels与跃迁Transition2．荧光技术研究的生物学样品的主要参数有哪些？量子产率与荧光强度的区别及关系是什么？荧光偏振的意义是什么？P234-237荧光分光光度术中的参量：(1)荧光光谱及主要谱参量荧光光谱包括：镜像对称。激发光谱(excitationspectrum)(波长：ex——最大激发波长)；发射光谱(emissionspectrum)(波长：em,max——最大发射波长)。(2)荧光强度(fluorescenceintensity,F,I)与量子产率(quantumyield,)A．荧光强度的定义：在一定激发波长(λex)作用下，发射的荧光强弱。由于发射的荧光为一光谱，所以发射的荧光强度常常是指发射某一波长的荧光。测得的F不是光能量的绝对值大小或光子数，而是在一定的仪器条件下测得的一种相对强度。B．=发射光子数/吸收光子数。表示某种物质的发光本领。任何物质的不会大于1，且同一物质在不同的环境下，不同。F=Ia，Ia=I0-I，I=I010-εcL→F=I0(1-10-εcL)→→当C很低时F=I0εcL→F与C成正比；→当C较大时F=I0→F与C无关。(3)荧光偏振(fluorescencepolarization)荧光偏振度Fluorescencepolarization--P=(I//-I)/(I//+I)荧光各向异性Fluorescenceanisotropy--A=(I//-I)/(I//+2I)荧光偏振度的物理意义：A：I//=I，P=0，自然光，荧光分子运动很快，取向随机。（稀溶液）B：I//或I为0，P=±1，偏振光，荧光分子运动很慢，取向有序。C：I//I0，0P1，生物大分子的荧光属于这种情况。(4)荧光寿命(fluorescencelifetime--)荧光衰减为原来激发时最大荧光强度的1/e所需要的时间。I=I0e-kt，=1/k(5)荧光探针(fluorescenceprobe)具有环状共轭双键即π电子系统；量子产率随环境变化，而且变化很大；能产生稳定荧光的小分子；藻胆蛋白phycobiliprotein绿色荧光蛋白GreenFluorescentProtein与研究对象的特定基团共价结合或与蛋白质非共价结合。3．举例说明荧光技术的应用？P239-2444．如果婴幼儿体内缺乏使苯丙氨酸转变为酪氨酸的酶时，则苯丙氨酸的含量异常增大而患“苯丙酮尿症”且易引起智力低下，所以，对婴幼儿的该项体查极为重要，但是，由于血液蛋白质中其它芳香氨基酸的影响而难以测出苯丙氨酸的含量，请用本课程所学内容提出一个检测方案。P239下-240上蛋白质中同时存在酪氨酸色氨酸苯丙氨酸时由于能量转移很难测出苯丙氨酸或酪氨酸，这时可用印三酮余苯丙氨酸特异性结核生成荧光衍生物的特点测定苯丙氨酸，其中激发峰365nm荧光峰515nm。婴幼儿在患苯酮尿时由于缺乏苯并转为酪氨酸的酶使苯丙含量高，引起智能低下，用上述方法只需50微升血清即可检查。NMR1题：NMR中外加磁场的作用?为了使自旋核产生能级分裂而对电磁波产生共振吸收。2题：.NMR中提高外加磁场的强度的作用?书247页18－2下边一段，提高外加磁场，增大能级差，以增加分辨率；抵消电子的屏蔽作用。为了满足共振条件：=H0，即可引起原子核两个能级间的跃迁。共振条件的推导在前两页。3题：NMR中如何区分化学位移和J偶合?理论上讲，同种原子核处于同样的磁场中能级裂分，接受射频时应该在同一位置发生共振。不同基团中的同种核，因屏蔽不同,造成共振峰位不同，从而产生不同的化学位移。详见p248。J耦合是核与核之间以价电子为媒介相互耦合引起谱线分裂的现象，即自旋裂分，见248页。化学位移与场强有关，J耦合与场强无关，由基团之间的自旋相互作用引起。通过调节分辨率可以区分，提高分辨率才会出现的是J耦合。具体见书248、249页。4题：如何理解NMR中峰宽?249页第二段，表示物质的量。蛋白质折叠：1.联系生物物理技术部分所学内容，哪些技术可以用来进行蛋白质折叠研究，其根据是什么？生物物理书P22-P23技术：CD：p227-228红外莱曼：p219荧光：p240依据：极性对荧光的影响Nmr：p251依据：化学位移红外光谱：1．液态红外光谱是否需要水作溶剂?为什么?试样中不应含有游离水。在溶液中测定光谱时，由于溶剂的种类、溶剂的浓度和测定时的温度不同，同一种物质所测得的光谱也不同。通常在极性溶剂中，溶质分子的极性基团的伸缩振动频率随溶剂极性的增加而向低波数方向移动，并且强度增大。水本身有红外吸收，会严重干扰样品谱，而且会侵蚀吸收池的盐窗。因此，在红外光谱测定中，应尽量采用非极性的溶剂。2．线性分子的振动自由度为什么是3N-5?红外光谱中是否能够观察到所有振动自由度对应的红外吸收峰?为什么?设分子由n个原子组成，每个原子在空间都有3个自由度，原子在空间的位置可以用直角坐标中的3个坐标x、y、z表示，因此，n个原子组成的分子总共应有3n个自由度，即3n种运动状态。但在这3n种运动状态中，包括3个整个分子的质心沿x、y、z方向平移运动和3个整个分子绕x、y、z轴的转动运动。这6种运动都不是分子振动，因此，振动形式应有（3n-6）种。但对于直线型分子，若贯穿所有原子的轴是在x方向，则整个分子只能绕y、z轴转动，因此，直线性分子的振动形式为（3n-5）种。每种简正振动都有其特定的振动频率，似乎都应有相应的红外吸收带。实际上，绝大多数化合物在红外光谱图上出现的峰数远小于理论上计算的振动数，这是由如下原因引起的：（1）没有偶极矩变化的振动，不产生红外吸收；（2）相同频率的振动吸收重叠，即简并；（3）仪器不能区别那些频率十分接近的振动，或吸收带很弱，仪器检测不出；（4）有些吸收带落在仪器检测范围之外。例如，线型分子二氧化碳在理论上计算其基本振动数为4，共有4个振动形式，在红外图谱上有4个吸收峰。但在实际红外图谱中，只出现667cm-1和2349cm-1两个基频吸收峰。这是因为对称伸缩振动偶极矩变化为零，不产生吸收，而面内变形和面外变形振动的吸收频率完全一样，发生简并。基本振动吸收峰数少于振动自由度的原因：(谱带)简并：不同振动形式的振动频率相同，其吸收峰在红外吸收光谱的同一位置出现。红外非活性振动：不能引起偶极矩变化(=0)，不吸收红外线的振动。3．CO2的红外光谱中能够观察到几个红外吸收峰?为什么?两个，一个是反对称伸缩振动的吸收峰，一个是变形振动的吸收峰，本应该有四个，但对称伸缩振动的偶极矩变化为零，不产生吸收；而变形振动包括面内变形和面外变形，他们的吸收频率一样，所以重合了。因此只有两个吸收峰.变形：667cm-1伸缩：2369cm-14.拉曼光谱中为什么Stokes线的强度远大于反Stokes线?S是从基态到激发态跃迁，而反S是有激发态到基态跃迁,反斯托克斯线的强度远小于斯托克斯线的强度，这是由于Boltzmann分布，处于振动基态上的粒子数远大于处于振动激发态上的粒子数。CD1WhenCDisappliedtoproteinswhatisthemainchromophore(absorbinggroup)thatislookedat?Whatwavelengthrangedoesitabsorbin?当元二色光谱应用于蛋白分析时，主要观察哪个吸收色段？主要吸收哪个波段？主要观察紫外区段，160-300nm2DoestheCDspectrumofaproteingivemostinformationaboutthe(i)primarystructure,(ii)secondarystructureor(iii)tertiarystructure?元二色光谱主要分析蛋白质的什么信息？主要结构，二级结构，还是三级结构？二级结构，分析蛋白质的二级结构是原二色光谱的最基础得应用。3DrawtheCDspectrumofanα-helix.Remembertolabeltheaxesandmarkimportantpointswiththeirvalues.画出α螺旋的图像，注意标记轴和重要点的值。黄色线课本227左下也有4WhyisnitrogengasusedinCDinstruments?氮气在原二色普分析仪中的作用？氮气保护装置5DoesCDgiveinformationaboutwherethehelicesareinaprotein?应用原二色普分析可以了解蛋白质的螺旋在哪吗？不能6MembraneproteinsaredifficulttostudybyCD.Trueorfalse?Why?膜蛋白难以用原二色普分析，真还是假?为什么？膜蛋白是近年来分子生物学研究的热点，膜蛋白是一类具有晶体类似结构的镶嵌于细胞膜上的蛋白，到目前为止，仅有为数不多的膜蛋白结构得到确认。研究表明，膜蛋白紫外电子光谱跃迁受到周围环境介电常数的影响，其原因可能是由于溶剂影响了电子由基态跃迁到激发态（n→π*,π→π*）的跃迁能量。不同于溶液环境中的蛋白质，膜蛋白镶嵌于疏水的脂质环境之中，因此，膜蛋白紫外CD光谱可能跟溶液状态下的CD信号有所区别。Wallace等研究表明，以现有的未包括膜蛋白的参考蛋白体系，采用SELCON3、CONTIN及CDSSTR等拟合运算程序预测具有富含α-螺旋及β-折叠的膜蛋白，其结果与溶液状态的蛋白CD光谱有差别，特别在190nm后尤为明显；并且溶液状态的CD光谱拟合蛋白结构结果与由[]xE-30200210220230240nmDSSP方法计算的膜蛋白晶体二级结构有差别。所以他们认为，现有的溶液参考蛋白体系不适合于CD拟合预测膜蛋白二级结构，提倡建立新的含有膜蛋白的参考蛋白体系。所以可以利用元二色谱分析膜蛋白，但要新的参考系。7.利用CD谱研究蛋白质的构象变化举例：对蛋白质或肽淀粉样变性的研究：ＡＤ（阿尔兹海默症）与正常细胞的蛋白质或肽形成纤维化结构淀粉样变性有关。ＬＲＲ是由２４个氨基酸组成的重复单位，在蛋白质中可以成串出现。ＬＲＲ家族的显著特点是１９位的天冬酰胺（N）基本不变，LRRN能够形成B折叠结构的长纤维使溶液凝胶化。同理LRRQ（19位变成谷氨酰胺也有同样的变化）在退行性疾病中氨基酸变成了天冬酰胺或者谷氨酰胺，是蛋白质淀粉样沉淀。利用CD可以显示溶液中LRRN和LRRQ的纤维化过程以及速率。自由基反应具有链反应的特点8用ESR自旋标记技术测定非顺磁生物大分子的运动情况所依据的主要两点是答案待定：要考就胡逼答吧！！1.自旋标记技术（将某些含孤电子的物质——自旋标记物（spinlabels）连接或掺入到那些本身不具有不成对电子的物质体系中，所纪录到的自旋标记物的ESR谱能反映与其连接或临近的本身不具有不成对电子的物质体系的某些性质，使得本身不具有不成对电子的物质体系也可用顺磁共振技术研究现象，此即为自旋标记技术。许多重要的生物大分子如脂、糖、蛋白等本身并不含有顺磁中心，正是依靠自旋标记技术，才能够用EPR进行研究获得了关于生物大分子结构、功能等很多信息。自旋标记技术极大地扩展了EPR技术的应用范围，为EPR技术的发展作出了重要贡献）2.不知道答自由基捕获行不?简答题1简述生物大分子的荧光发光机理及影响荧光强度的因素荧光生色团+P2322研究蛋白质二级结构的常用方法有哪些？对于一个结构位未知的蛋白质，请用生物物理学知识设计一个实验，研究其二级结构，并叙述实验原理P133试述呼吸爆发的杀菌机制P1434核磁共振的基本原理是什么？为了提高核磁共振分辨率，可以通过提高核磁共振