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1Westernblot实验报告摘要：目的：学习并掌握westernblot分离蛋白及观察方法方法：westernblot结果：见后文结论：westernblot能很好地分离蛋白关键词：westernblot、分离、小鼠组织、蛋白WesternblottestreportAbstract:objective:LearnandmasterthewesternblotproteinisolatedandobservationmethodMethods:westernblot：,sds-pageandelectrictransferResults:seebelowKeywords:Westernblot、separate、mousetissues、protein前言:免疫印迹又称Western印迹(Westernblotting)，与DNA的Southern印迹技术相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜)，然后用探针检测特异性组分。不同的是，Westernblotting所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。目前，Westernblotting广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。免疫印迹可分成两个步骤：蛋白质由凝胶转移至固相基质；特异性抗体检测。蛋白质转移通常由电泳实现，现常用的方法有二：1半干法：将凝胶和固相基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间，通电10-30分钟可完成转移；2湿法：将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电45分钟或过夜课完成转移。本试验采用湿法转移。免疫印迹用膜通常有硝酸纤维素膜和尼龙膜两种。大多数应用前者。本实验也用硝酸纤维素膜进行转移。1试剂与仪器1.1试剂（所有试剂均供两组用）1.1.18%电泳分离胶的配制H2O6.9ml230%丙烯酰胺4.0ml1.5mol/LTris3.8ml10%SDS0.15ml10%过硫酸胺溶液0.15mlTEMED0.015ml1.1.25%浓缩胶配制H2O5.5ml30%丙烯酰胺1.3ml1.0mol/LTris1.0ml10%SDS0.08ml10%过硫酸胺溶液1.08mlTEMED0.015ml1.2仪器夹心式电泳槽，电泳仪，硝酸纤维素膜，直径9cm培养皿，剪刀，镊子，刀片，微量移液枪，普通滤纸2试验步骤2.1蛋白质的提取2.1.1取小鼠组织0.2g，用生理盐水洗去表面毛发等杂物，剪碎，加入生理盐水2ml；2.1.2移入匀浆器，匀碎2.1.3用移液枪移取1ml匀浆液入1号EP管中；2.1.4离心12000转，10min2.1.5取1号EP管中层清液入2号EP管2.1SDS-PAGE电泳分离2.1.12片玻璃片以清水洗净，再以卫生纸擦干，欲做胶的那一面以酒精洗净，再以拭镜纸擦干净，最後將2片玻璃片贴好。將2片玻璃片放入造胶台中，注意2片玻璃片的底部需相当平整，再將水加滿，观察5分钟后水外漏的比率，若外漏速率太快，则拆掉重新摆放。倒掉2片玻璃片间的水，用滤纸將水吸除，尽量完全吸干，避免胶体浓度不足2.1.2使用塑胶滴管將配好的溶液加入製胶台中，約加到绿色橫桿下缘，尽量不要太多，否則齿梳會直接刺到下层胶(上胶预留2cm空間)，在上面铺一层水，与空气隔绝，加速凝固。2.1.3倒掉H2O，用滤纸將水吸干，但不要碰到胶，用塑胶滴管吸取上胶的溶3液，滴入至玻璃片全滿的位置，將齿梳插入，含有acrylamide之溶液有毒，避免接触到身体，此時液体可能会喷出2.1.4等待20分钟，可以观察烧杯留下一些剩余液体，可以判断凝固程度，如果烧杯中的残留液体凝固，则代表胶体已经凝固，拆除齿梳。2.1.5紅色在左邊，黑色在右邊，小格之runningbuffer需加到全滿；大格的runningbuffer之需要加到淹過白金线即可。蓋上上蓋，转到电压那部分，上胶跑90V/70V；下胶跑110V/100V。(看到marker顏色分開即转至110V)，跑80min。2.2转移蛋白质到硝酸纤维素膜上（电转移）2.2.1切割与胶尺寸相符的硝酸纤维素膜，用转移缓冲液浸泡5min使没有气泡。2.2.2剪2张滤纸与胶尺寸大小相符，将其与海绵一起浸泡在转移缓冲液中。2.2.3打开转移槽的胶板，依次放入：a.一张浸湿的海绵；b.一张用转移缓冲液饱和的滤纸；c.用转移缓冲液冲洗过的胶，并小心的赶走滤纸和胶之间的气泡；d.硝酸纤维素膜，正面对着胶，在胶和膜的右下角剪一小角，以标明方向；e.一张用转移缓冲液饱和的滤纸；f.一张浸湿后的海绵。2.2.4小心的合上胶板，并立即放入转移电泳槽中。加转移缓冲液至满。2.2.5插好电极，注意正负极方向，胶侧为负，NC膜侧为正。打开电泳仪开关调至稳压60v，电泳2h，转移结束后打开胶板取出硝酸纤维素薄膜。2.3染色、脱色2.3.1转移结束后，取出塑料支架，依次去掉各层2.3.2用铅笔或剪刀在NC膜的上缘作好标记，将NC膜放入盛有丽春红的培养皿中8分钟，再经自来水脱色，观察转移结果。将转移后的凝胶放入氨基黑染液中染色1分钟，再经洗脱液脱色，观察转移结果。(注意电泳缓冲液、转移缓冲液要回收)3实验结果3.1显色后的凝胶及印迹膜4图1：显色后的凝胶及印迹膜4讨论5.1从实验结果我们可以看到，凝胶上的有几个样品的蛋白分离程度还可以，但是中间大部分都模糊不清，甚至是没有跑出多少蛋白。为什么一样的实验条件却做出不一样的结果呢？可能的原因有：①没有处理好样品，导致提取的蛋白量不多，或者不纯；②加样时意外打到电泳液中等5.2本实验所用的免疫印迹方法，其方法简单，方便迅速，特异性强。ELISA是由抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。并且抗原与抗体的结合，在一定浓度范围内，只有当两者分子比例合适时，才出现可见反应。5.3转移之后，蛋白质在硝酸纤维素膜两面分布不完全相同，因此显色反应同时注意两面的信号。