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--343第八章代谢平衡试验与物质代谢试验平衡试验葡萄糖氧化率同位素示踪代谢试验蛋白质代谢的动力学研究糖代谢的动力学研究钙代谢研究代谢平衡试验（metabolicbalancestudy）是研究物质在体内代谢的一种重要方法。在十六世纪，SantorioSanctorius对非显性出汗的研究开创了代谢平衡研究的先河。之后，vonWendt以自身为研究对象，于1905年发表了第一篇代谢平衡研究论文。随着科学技术的发展，代谢平衡试验研究得到不断深入和发展，人们对体内各种物质代谢过程的了解亦逐渐加深。目前，这一试验已被广泛应用于各种条件下的物质代谢研究。代谢平衡试验的目的是了解某种物质在体内的吸收、分布、排泄的代谢过程，探讨疾病的病因和病理。代谢平衡试验适应症有：各种生理情况、疾病条件下糖、蛋白质、脂肪、电解质、矿物质和微量元素的代谢环节、定位和代谢量与途径，以及药物或毒物的吸收或代谢等。但多汗、发热、腹泻、呕吐或伴有慢性消耗性疾病者都不宜接受本试验。【平衡试验】一、原理在机体相对稳定的条件下，测定一定时间内某物质的摄入量和各种排泄物的排出量，以了解该物质的摄入和排出的关系。如测定结果为摄入小于排出，则该物质有丢失，为负平衡；如摄入大于排出，表明该物质在体内积存，属正平衡；摄入等于排出，为平衡状态。但在实际工作中，由于实验方法、测定误差和个体差异等的固有影响及伪差，不能单凭实验结果的数值做出结论。一般来说，测定方法越粗糙，实验误差也越大。个体差异因人而定。群体研究时，可用统计概率公式确定。但由于代谢平衡试验的方法选择的对象有限，一般要同时有非相关群体的对照观察。如自身对照试验前后配对研究，则个体差异较小。以往用化学方法测定尿、粪及食物中的无机盐或氮含量，由于实验误差来源较多，在缺乏对照的条件下，有人主张以5%~10%作为实验误差基值。也就是说，摄入与排出的物质量在总摄入量的5%~10%范围内时，可视为总平衡（totalbalance），即总体水平上的平衡状态（balancestate）。当然，如有对照，可凭统计学结果作出结论。近代的平衡试验多用稳定同位素作标记示踪剂，由于误差减少，操作环节简化，总平衡的概念应从新规定。二、实验设计--344（一）实验计划和对照观察一般可分为两类：①用A个体的结果同B个体进行比较。②同一个体在一种处理程序（包括饮食、药物、生活安排等）与另一种处理程序下的结果进行比较。因为个体差异性较大，故后一种方法的结果比较可靠[1]。（二）实验期限取决于研究内容。代谢平衡试验常以3~4天为一代谢期。代谢期太长，费时，且不利于观察对象的变化；代谢期太短，则粪便标本可能出现较大误差。如需要，留尿的间隔可以缩短，可分为24小时或48小时，亦可每8或12小时收集标本一次。进食实验膳食数天后方可收集标本，这一时期称为过渡期或适应期。其目的在于使机体在这一特定的条件下达到相对稳定状态。过渡期的长短可根据该物质在体内代谢的时间而定，一般为1~2天。同一受试对象在接受不同干预时，需有足够的间隔期。（三）实验膳食根据研究目的和受试对象的饮食习惯，由营养师配制实验膳食。营养师首先要调查受试者自由饮食时的情况，然后制定食谱。要确保能量供应，并注意食物中其它相关物质的含量。试验前应试进食一天，以及时调整食谱，确保试验期间受试者能完全摄入所规定的食物。如有剩余，应及时送至实验室检查，并从总摄入中减去。由于自来水和天然水中所含矿物质浓度较高，所以烹饪和饮用的水都需用蒸馏水。（四）标记物的使用为了保证粪便标本收集的准确性和完整性，常使用肠道不吸收物质作为标记物。卡红（carminered）口服后大便呈红色，可在试验开始和结束时服用，作为划分实验期限的标志物。活性碳使大便呈黑色，亦可使用。此外，还可在每餐进食时加用另一种不吸收的标记物，用于校正粪便中该物质的含量。常用的有聚乙烯二醇（polyethylenglycol,PEG）、Cr2O3、CrCl3和51Cr。（五）实验期间的活动可进行适当的轻度体力活动。保证体重无明显变化。但要注意避免显性出汗。大汗可增加水、电解质和某些物质的丢失。（六）粪便和食物标本灰化或消化[2]可视测定内容的需要采用不同方法1．干灰化法通过高温灼热使样本脱水、焦化。在空气中氧的作用下，使有机物氧化分解成二氧化碳、水和其他气体挥发，残留的无机物供测定用。该方法适用范围广，可用于很多微量元素的分析。操作简便，需要设备少，灰化过程中不需要人看守，并适合于大批量样品的处理，省时省事。缺点是由于敞口灰化，温度高，容易造成待测成分的挥发损失；其次是某些待测成分吸留于坩埚的孔穴中很难溶出，致使回收率降低。2．湿消化法在样品中加入硝酸、高氯酸、硫酸等强酸，加热破坏有机物。硝酸是强氧化剂，但由于沸点较低，在高温条件下易扩散，氧化能力不持久。因此当消化过程需要补加时，应先冷却。其优点是对金属具有较强的溶解能力，除了金和铂以外，几乎能溶解所有的金属。高氯酸在低温时没有氧化能力，但加热时是一种强氧化剂，其氧化能力强于硝酸和硫酸，可分解所有的有机物，消化速度也快。但需注意，在高温下，高氯酸直接接触某些还原能力强的物质（如酒精、甘油、糖类、次磷酸及其盐）时，因反应剧烈有发生爆炸的可能，故一般不单独使用，并且要避免消化液烧干，以免发生危险。浓硫酸在加--345热条件下具有一定的氧化能力，但不如高氯酸和硝酸，它只能使样品中的蛋白质氧化脱氨，而不会进一步氧化成氮氧化物。浓硫酸对有机物有强烈的脱水作用，并使其炭化。此外，硫酸具有沸点高（338℃），不易挥发损失等优点。有时还需加入一些氧化剂（如高锰酸钾、过氧化氢等），以加速样品的氧化分解，完全破坏样品中的有机物，使待测的无机成分释放出来，并形成各种不挥发的无机化合物，以便作进一步的分析测定。常用的消化方法：①硫酸消化法如用凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量，可用此法来进行消化。由于硫酸的氧化能力较弱，消化液炭化变黑后，保持较长的炭化阶段，使消化时间延长。可适当加入某些氧化剂。②硝酸-高氯酸消化法可先加硝酸进行消化，待大量有机物分解后，再加入高氯酸。此法反应速度快，炭化过程不明显；消化温度低，挥发损失少。但由于两种酸经过加热都容易挥发，故当温度过高、时间过长时容易烧干，并可能引起残余物燃烧或爆炸。③硝酸-硫酸消化法在样品中加入硝酸和硫酸的混合液，或先加入硫酸。加热使有机物分解，在消化过程中不断补加硝酸。此法可缩短炭化过程和消化时间，反应速度适中。但因含有硫酸，不宜作碱土金属的分析。三、实验步骤（一）试验膳食调查受试者的饮食习惯，根据研究目的制定食谱。试进食实验膳食一天，调整食谱。进食实验膳食1~2天（过渡期）。每餐同时服用PEG1克。在实验期第一天及实验结束后第一天的早餐前服用卡红0.3克（装于胶囊内），或服活性炭0.5克。实验期每餐亦同时服用PEG1克。（二）尿标本的收集实验期第一日上午7时令受试者排空膀胱，将尿液弃去，然后收集每日24小时尿液。用浓盐酸防腐（每100毫升尿液加0.5毫升浓盐酸）。容器上需注明受试者姓名、实验日期等，以防混淆。测定每日尿液总量。留取部分尿液，置-20℃保存待测。（三）粪标本的收集和处理从第一次服用卡红后大便变为红色起，至第二次服用卡红后大便出现红色前，收集所有的大便。每日可用浓盐酸或20%硫酸20毫升防腐。测脂肪一般用冰醋酸20毫升防腐。粪便标本需储放阴凉处。将全部粪便标本移入捣碎机中，加适量蒸馏水，将大便捣成糊状。如标本较多，可分成数次进行，然后混匀所有标本。将糊状粪便标本倒入一带塞且有刻度的大号容器内，视标本量的多少稀释到1000~3000毫升，用力摇匀。记录大便总量，留取部分样品。（四）粪标本灰化或消化主要有两种方法：①干灰化法，首先将大便溶液5毫升冷冻干燥（-18℃72小时），然后放入瓷坩埚内或白金杯内，置于高温炉中（600℃48小时），用浓盐酸10毫升溶解剩余物，将溶液滤入100毫升带塞量瓶中，浓盐酸冲洗滤纸5次。用蒸馏水稀释至100毫升后待测。②湿消化法，取大便溶液5毫升注入凯氏烧瓶，加入适量的消化液，将瓶倾斜呈45°，用电炉加热瓶的底部，直至消化完全为止。由于有大量消化酸雾和消化分解产物逸出，故需在通风橱内进行。也可将样品和消化液放入硬质--346锥形瓶中，瓶口放一小漏斗，置于电热板上进行加热消化。在消化过程中需要补加酸或氧化剂时，首先要停止加热,待消化液稍冷后沿瓶内壁缓缓加入，以免发生剧烈反应，引起喷溅，造成对操作者的危害和样品的损失。消化完全的样本应为无色液体，冷却后移入100毫升容量瓶内，稀释至100毫升待测。（五）食品取样和处理膳食成分的测定，有两种方法：一种方法是按照食物成分表计算，另一种方法是直接分析食物的样品。按照食物成分表计算的结果，只能供营养师配制膳食时参考之用。不同时间和不同来源的食物成分，可能有相当大的差异。计算的结果与实际分析的结果往往有较大的差别，所以不能作为分析研究资料的数据。准确的代谢研究必须采用直接分析法。食物的样品可于配制实验膳食时另外配制完全相同的一份作为分析用。但全份食物浪费较大，一般可用全份食物的1/3或1/5。标本处理方法同前。四、结果分析标本分析后须审查换算步骤，如稀释倍数等。尿、粪排除量可用肌酐和标记物校正。常用的参数：平衡值=每日或总摄入量—[每日或总粪排除量+每日或总尿排除量]；肠净吸收率={[每日或总摄入量—每日或总粪排除量]/每日或总摄入量}×100%在解释结果时，要考虑实验本身可能发生的误差。个体试验的正或负平衡值小于摄入总量的10%时，有可能是机体调节或试验误差所致，不一定具有重要的实际意义。该方法是一种传统的了解物质代谢平衡的方法，曾被广泛应用于各种生理条件下各物质需求量和病理条件下某一物质代谢的研究[3~6]。但它仅能反映整体的正负平衡变化，不能显示体内的代谢途径和详细变化，也无法计算内生性物质。此外，从皮肤、汗液、头发等部位丢失的部分无法计算，存在一定的局限。【同位素示踪代谢试验】一、放射性核素示踪法放射性核素示踪是利用放射性核素或其标记物作为示踪剂，采用口服或静脉注射的方法引入体内，从体外或取标本观察示踪物的去向，以了解机体在生理、病理过程中物质的吸收、分布、代谢和排泄。放射性核素或其标记物的化学性质及生物性质与相应的非标记物的性质完全相同，即它们在生物体内所发生的化学变化、免疫学反应和生物学过程都是完全相同的，但却有不同的物理性质，既放射性核素可发射出射线，通过核测量仪器可对射线进行测量和定量，观察被放射性核素所标记物质。用放射性核素研究物质代谢的示踪实验，除前面平衡实验设计中需要考虑的问题外，还包括以下几个方面。（一）放射性示踪物的选择主要根据实验目的、实验周期和测量方式考虑[7]。1．核素的半衰期所用半衰期过长或过短的核素都不合适。半衰期过短的核素，实验尚未结束，其放射性已衰变过多，导致测量困难；使用半衰期太长的核素，则放射性物质在机体内残留时间太长，对机体不利。实际工作中除考虑核素的物理半衰期外，还要考--347虑该示踪物在体内的生物半衰期。有些示踪物虽然物理半衰期很长，但在体内停留时间不长（生物半衰期短），同样可安全使用。如14C的物理半衰期为5千多年，有利于运输和保存，但它的生物半衰期只有10多天。因此，应根据实验周期，同时注意考虑示踪物的物理半衰期和生物半衰期，即该示踪物的有效半衰期。2．放射性核素射线的类型一般α粒子很少用于生物示踪实验。γ射线穿透力强，发射此类射线的示踪物样品制备和测量都比较简便，在体外观察示踪物于体内运动规律，则必须使用发射γ射线的核素标记物。发射β射线的核素如3H、14C、32P等大多数可以进行同位素标记（既以放射性原子替代原来非放射性的相同原子），各种代谢转换的研究多选用发射β射线的核素。3．足够的放射化学纯度和比活度对放射化学纯度的要求是不应有放射性杂质（包括其他放射性核素及同一核素标记的其他化合物或游离的放射性核素），其放射化学纯度应在95%以上，放射化学纯度的降低势必干扰示踪实验的测量结果。由于放射性示踪剂在体内应用过程中都会被大量稀释，并