搜索
Loop-mediatedIsothermalAmplification(LAMP)(LAMP)LAMP法为已知基因的检测提供LAMP法为已知基因的检测提供“简便、快速、准确、廉价”的基因检测方法。★利用该方法「简便」、「廉价」的特性、可将基因检测推广至尚未普及的领域与地区。★为满足基因检测或基因扩增的现场（例如病房临床现场检测）「快速」（30分钟以内）获得结果的需求，我们提供了一种「简便」、「准确」的基因检测扩增技术。得结果的需求，我们提供了种「简便」、「准确」的基因检测扩增技术。什么是LAMP法？■LAMP法LAMP法是“Loop-MediatedIsothermalAmplification”的简称、是荣研化学独立研发可取代PCR的一种“简便、快速、准确、廉价”的基因扩增方法。LAMP法的特征是针对目标DNA链上的六个区段设计四个不同的引物然后再利用链置换反应在定温度下进行反应反应只需要把基因模板引物链置换型DNA用链置换反应在一定温度下进行反应。反应只需要把基因模板、引物、链置换型DNA合成酶、基质等共同置于一定温度下（60～65℃）、经一个步骤即可完成。扩增效率极高，可在15分~1小时内实现109～1010倍的扩增。而且由于有着高度的特异性，只需根据扩增反应产物的有无即可对靶基因序列的存在与否作出判断。■特征●不需要使双链DNA先变性成单链。●扩增反应在等温下可持续进行。●扩增的效率极高。●针对六个区段使用四种不同的引物，可特异性扩增靶基因序列。●仅使用一种链置换型DNA聚合酶，成本低廉。●扩增产物是在同一条DNA链上互补序列周而复始形成大小不一的结构。●扩增产物是在同条DNA链上互补序列周而复始形成大小不的结构。●当模板是RNA时，仅需加入逆转录酶即可与DNA一样进行扩增。1■引物的设计首先在靶基因的3’末端设定F3c、F2c、F1c三个区段，在5’末端设定B1、B2、B3三个区段。针对这六个区段我们设计了如下四个引物。FIPF25'3'F1cF35'F33'TargetDNA5'3'5'3'PrimerF1cF2cF3cB1B2B3F1F2F35'3'B3Primer3'5'3'B3B3cB2cB1cBIP3'B2B1c5'1.FIP：FIP引物在3‘末端含有与F2c互补的F2区段，在5’末端含有与F1c相相同序列的区段。2.F3Primer：F3引物含有与目标DNA上的F3序列相同的区段。3.BIP：BIP引物在3‘末端含有与B2c互补的B2区段，在5’末端含有与B1c相同序列的区段。4.B3Primer：B3引物含有与目标DNA的B3相同序列的区段。关于各引物的设计，请用「LAMP法引物设计支持软件」，设计中请特别注意碱基组成、GC含量、二次结构等问题。Tm值可用NearestNeighbor法求得。引物设计的要点・F2、B2、F3、B3的3’末端应极力避免ATRich设计。扩增领域为F2B2区段间应该在200b以内・扩增领域为F2～B2区段间，应该在200bp以内。・包含F2/B2在内的环状部分的长度在40～60bp范围内。・各区段的Tm值应该在60～65℃之间。・若只是为了鉴定靶基因存在与否，F1-B1的间距可以为零。・引物应避免二次结构发生。・各引物的3‘端不可含有与其他引物互补的序列。2有关于「LAMP法引物设计支持程序」请参照富士通株式会社的NetLaboratory（）■反应原理将靶基因（例如：DNA模板）与所有反应试剂一起放入65℃恒温槽进行反应，即会发生以下的过程。1.双链DNA在65℃左右时会处于动态平衡的状态。这时任何一个引物与双链DNA互补部分进行碱基配对延伸时，另一条链就会脱落成为单链。因此、LAMP法不需要像PCR法一样得先从双链DNA变性成单链DNA始可进行反应。扩增机制方面我们将从FIP引物与单链的模板DNA上互补区段接合的部分开始讲解（1）。3’5’3’5’65℃F3F1F2B1cB2cB3cF3cF2cF1cB1B2B3TargetDNA（1）5’鎖置換型DNA聚合酶B1F3cF2cF1cB2B33’5’F1cF23’FIP2.通过链置换型DNA聚合酶的作用，以FIP引物的3‘末端为起点，与模板DNA链互补的DNA链就形成了（2）。（2）5’3’F3cF2cF1cB1B2B35’F1B1cB2cB3cF23’3.F3引物再从FIP引物的外侧与F3c区段接合，以F3引物的3’末端为起点，通过链置换型DNA聚合酶的作用一边将刚才从FIP引物合成的DNA链剥离，一边合成新的DNA链(3)。F1cF1B1cB2cB3cF24F3引物通过链置换反应与碱基配对延伸形成了与目标DNA互补的双链（4）。（3）5’3’3’F3cB1F2cF1cB2B35’F1cF2B1cB2cB3cF1F3Primer4.F3引物通过链置换反应与碱基配对延伸形成了与目标DNA互补的双链（4）。F3cB1F2cF1cB2B35’F3F1F2B1cB2cB3c5’3’3’（4）35.刚才被F3引物合成的DNA所剥离的单链（5）由于在5‘末端含有互补的F1c与F1区段，所以通过自我碱基配对而形成环状结构（6）。6.BIP引物与上述的DNA链（6）结合进行碱基配对，以BIP引物的3‘末端为起点合成互补的DNA链并在过程中将循环结构剥离延伸成直线结构。接着B3引物从BIP引物（5）5’3’F2F1cB1cB2cB3cF1的外侧插入进行碱基配对，以3’末端为起点，通过链置换型DNA聚合酶的作用，一边剥离先前合成的BIP引物DNA链，一边持续DNA合成。（6）F1B1cB2cB3c3’7.(6)的单链通过链置换DNA聚合酶的作用则形成下图的双链（7）。B1cF2F1c5’B25’B3PrimerBIP（7）F1cB1cF2F1B2cB3c5’3’F1B1F2cF1cB2B33’5’8.另外由(6)中被剥离的单链因为在3‘末端含有互补的F1c与F1区段，5’末端含有互补互的B1与B1c区段，所以整条链会形成如同哑铃状的结构。而这个结构，就是我们LAMP法的扩增循环的起始结构（8）。以上为LAMP法扩增循环起始结构的形成过程。F1（8）F1cB1B2B1cF1F2c5’3’（）4■原理（2）LAMP法的扩增循环9.首先在(8)的结构中，以3’末端的F1区段为起点，以自身为模板进行DNA合成延伸。此时5’末端的环状结构被剥离延伸。因为3‘末端环状的F2c区段处于单链状态，FIP引物可以与之进行碱基配对，并以F2的3’末端为起点，一边剥离以F1为起点先合成的物以与行碱对并以的末端为起点剥离以为起点先成的DNA链，一边进行DNA合成延伸。10.接着在(8)中，由F1延伸而得的DNA链被FIP引物延伸而得的DNA链剥离成单链，因为在3‘末端存在互补区段，从而形成环状结构，并在环状结构的B1区段的3’末端开始进行以自身单链为模板的DNA合成（9）。然后这条DNA一边剥离双链部分中FIP引物延伸得到的DNA链，一边继续延伸，形成(10)的结构。11.通过上述过程，FIP引物延伸而得的DNA链被剥离，成为单链，而其两端分别存在互通过上述过程，引物延伸而得的链被剥离，成为单链，而其两端分别存在互补的区段F1、F1c与B1c、B1，经由自我碱基配对形成哑铃状结构。可以看出(11)就是(8)的对应结构。12.(11)的结构和(8)的结构相同，以B1区段的3’末端为起点，以自身为模板进行DNA合成，另外，BIP引物在单链的B2c区段进行碱基配对，一边剥离B1区段延伸而得的DNA链，以便进行DNA合成延伸。由此经过与(8)至(11)相同的过程，又再生成(8)的结构。13.同时，在(10)的结构中，BIP引物一边对单链的B2c区段进行碱基配对并剥离双链部分，一边进行DNA链的合成。通过此过程，结果在同一根链上互补序列周而复始形成大小不一的结构。（8）F1cF1cF1cF1cF1cF1F1F1F1cF1F2F2F2F2cF2cF2cB1B1B1B1cB1cB1cB2B2B2cFIPFIP(9)F1cF1cF1cF1cF1cF1F1F1cF1F1F2F2F2cF2cB1B1B1B1B1cB1cB1cB1cB2B2F2cF1B1B1cB2cB2cB2c(11)(10)F1cF1c1F1F1F1F2F2F2cB1B1B1B1B1cB1cB1cB1cB1cB1cB2B2B2B2cB2cB2cBIPF1cB1B1cBIP5LAMP法的操作步骤-标准法-■使用试剂DNA的扩增：需要使用以下试剂：4种不同的引物（FIP、F3引物、BIP、B3引物）链置换型DNA聚合酶基质（脱氧核苷三磷酸）基质（脱氧核苷三磷酸）反应缓冲液RNA的扩增：只需在DNA的扩增试剂的基础上添加逆转录酶。■LAMP法的操作操作简便，只需把样本（含有靶基因）与上述试剂混合在65℃保温１小时就可以检测扩增产物或者判定扩增与否。靶基因（DNA或RNA模板）引物（FIP,F3,BIP,B3）链置换型DNA聚合酶(DNAPolmee)检测结果(DNAPolymerase)dNTPs反应缓冲液逆转录酶（模板为RNA时）65℃15分钟~1小时●就这样，LAMP法不需要改变温度，只需把试剂都加入反应试管中，包括变性步骤的●就这样，LAMP法不需要改变温度，只需把试剂都加入反应试管中，包括变性步骤的全过程能在等温条件下短时间内完成，可以检测扩增产物或者判定扩增与否。因此LAMP法是简便、快速的基因扩增法。●并且LAMP法通过4种引物识别６个区段，只针对靶基因进行扩增，是准确的基因扩增法。●另外，由于LAMP法具有以下特点：1)不需要特殊试剂、2)扩增不需要改变反应温度因此不需特别的温控设备3)根据扩增的有无就能测定靶基因是否存在只需温度，因此不需特别的温控设备、3)根据扩增的有无就能测定靶基因是否存在，只需要简单的检测仪器、所以成为了总成本低廉的基因检测手段。●LAMP法为简便的基因检测法，可进行实时检测。使用了环引物后，扩增时间更可缩短为原来的1/2到1/3（快速法（后述））。6LAMP法的高灵敏度、简便检测、时间缩短DNA的扩增实例（HBV）■检测灵敏度HBV的扩增试验，经过65℃１小时扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳（浓度2％），结果表明模板浓度在6拷贝以上时有基因扩增反应发生。因为在LAMP法中靶基因互补序列周而复始循环形成大小不同的结构，所以会呈现出照片中所示的电泳图像出照片中所示的电泳图像。用限制性内切酶EarI去消化扩增产物，就会形成集中条带。再对这一条带进行测序，结果证明它们全部都是靶基因序列。RNA的扩增实例（PSAmRNA）PSA表达mRNA扩增试验，左图是把经过65℃１小时扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳（浓度2％）的结果。在100万个PSA非表达的K562细胞中混在的1个及10个PSA表达细胞（LNCaP）在的1个及10个PSA表达细胞（LNCaP）的mRNA发生了扩增。与HBV的情况一样，用限制性内切酶Sau3AI去消化扩增产物，就会形成集中条带。7■验证简便应用浊度的简便验证扩增反应会产生一种叫焦磷酸镁的衍生物。此衍生物与生成的扩增产物成正比由于LAMP法能产生大量的扩增产物比。由于LAMP法能产生大量的扩增产物，衍生物的产量也会大增，于是呈现出如左图所见的白色浑浊。因此，通过看白色浑浊的有无，可验证是否有靶基因的存在。白色浑浊形成的原理白色浑浊形成的原理DNA的复制过程中当一个dNTP分子结合到DNA链上的同时会解离下一个焦磷DNA的复制过程中，当一个dNTP分子结合到DNA链上的同时会解离下一个焦磷酸根离子（PPi），PPi与反应液中的镁离子结合生产白色沉淀Mg2P2O7。在LAMP反应中，由于DNA产物量巨大，随之而来的副产物Mg2P2O7量很大，因此通过肉眼观察白色浑浊就可以判定结果。8应用荧光目视试剂的简便验证钙黄绿素（鳌合剂）与试剂中的锰离子结合处于淬火状态钙黄绿素（鳌合剂）与试剂中的锰离子结合处于