药品生物检定技术

全国高职高专药品类专业第二轮规划教材—《药物分析》第八章药品生物检定技术简介Page2药品生物检定技术是指利用生物体（微生物、细胞、离体组织或动物）对药物的特定药理、毒理作用，来测定生物药品的效价、检查药品中的有害物质以及对制剂进行微生物限度或无菌检查的技术方法Page3无菌检查微生物限度检查抗生素效价的微生物检定法生化药物效价的生物测定法药品的安全性检查Page4第一节无菌检查Page5概述无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。将药品或材料，在严格的无菌操作条件下，接种于适合各种微生物生长的不同培养基中，置于不同的适宜温度下培养一定的时间，逐日观察微生物的生长情况，并结合阳性和阴性对照试验的结果，判断供试品是否无菌。包括薄膜过滤法和直接接种法两种方法Page6一、常规技术要求1.应在环境洁净度10000级以下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行检查。2.全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染。3.单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。Page7二、培养基（一）培养基的种类：7种硫乙醇酸盐流体培养基（需氧菌、厌氧菌培养基）改良马丁培养基（真菌培养基）选择性培养基0.5%葡萄糖肉汤培养基（用于硫酸链霉素等抗生素的无菌检查）营养肉汤培养基营养琼脂培养基改良马丁琼脂培养基Page8二、培养基（二）培养基的适用性检查证明：培养基无菌，且能保证细菌生长良好1.无菌性检查无菌性检查每批培养基随机取不少于5支（瓶），培养14天，应无菌生长Page9二、培养基（二）培养基的适用性检查2.灵敏度检查灵敏度检查方法：取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天；取每管装量为9ml的改良马丁培养基5支，分别接种小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，培养5天。逐日观察结果。结果判断：空白对照管无菌生长，加菌培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定Page10二、培养基（二）培养基的适用性检查适用性检查的菌种：金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌生孢梭菌、白色念珠菌黑曲霉图片取自青岛海博生物技术有限公司Page11三、方法验证试验建立产品的无菌检查法时，应进行方法的验证证明所采用的方法适合于该产品的无菌检查–排除供试品是否具有抑细菌和抑真菌作用–避免假阴性结果方法：薄膜过滤法、直接接种法Page12四、无菌检查法（一）检验数量及检验量《中国药典》现行版附录批出厂产品最小检验数量表液体制剂最小检验量及上市抽验样品的最少检验数量表固体制剂最少检验量及上市抽验样品的最少检验数量表Page13四、无菌检查法（二）对照试验1.阳性对照必须长菌，用以证明微生物确实可在应用的试验条件下生长•根据供试品特性选择阳性对照菌•无抑菌作用和抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌•抗革兰阴性菌为主的供试品，以大肠埃希菌为对照菌•抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌•抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌•阳性对照管培养48～72小时应生长良好Page14四、无菌检查法（二）对照试验2.阴性对照不得长菌，用以检查试验过程中使用的溶剂、稀释液、冲洗液等对微生物生长及存活无影响Page15四、无菌检查法（三）检查方法1.薄膜过滤法通过滤膜过滤，将供试品中可能存在的微生物富集于滤膜上，再冲洗掉滤膜上的抑菌成分后，在薄膜过滤器滤筒内加入培养基，在所需温度下培养，观察是否有菌生长Page16四、无菌检查法（三）检查方法2.直接接种法3.培养及观察将含培养基的容器在规定的温度培养14天，逐日观察并记录是否有菌生长。必要时可转种及涂片Page17五、无菌检查结果判断（三）检查方法1.阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。否则，试验无效。2.若供试品管显澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定。3.若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。4.试验若经确认无效，需依法重试。Page18第二节微生物限度检查Page19微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受到微生物污染程度的方法，检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。微生物限度检查成为非规定灭菌制剂保证药品质量的重要检查内容，也是综合评价药品生产各环节卫生状况的一个依据。Page20一、常规技术要求及检验量（一）技术要求1.检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。2.单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。3.供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物无毒性。4.细菌培养温度为30～35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23～28℃；控制菌培养温度为35～37℃。5.检验结果以1g、1ml、10g、10ml或10cm2为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告。Page21一、常规技术要求及检验量（二）检验量一次试验所用的供试品量(g、ml或cm2)。除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；膜剂为100cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml。检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂还不得少于4片。一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小包装单位）的3倍量供试品。Page22二、样品供试液的制备《中国药典》现行版附录中提供了液体供试品、固体、半固体或黏稠性供试品以及需用特殊方法制备供试液的供试品的供试液制备方法。需用特殊方法制备供试液的供试品有：非水溶性供试品、膜剂供试品、肠溶及结肠溶制剂供试品、气雾剂、喷雾剂供试品及具抑菌活性的供试品。Page23三、菌种及培养基（一）菌种1.细菌、霉菌、酵母菌计数检查的对照试验菌种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉2.控制菌检查的对照菌种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌、白色念珠菌Page24三、菌种及培养基（二）培养基1.细菌、霉菌及酵母菌计数检查常用的培养基营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、改良马丁培养基、改良马丁琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基。2.控制菌检查常用的培养基用于菌液制备的营养琼脂培养基等常规培养基胆盐乳糖培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基等20余种用于培养基适用性检查、方法验证试验及供试品检查的培养基。Page25三、菌种及培养基白色念珠菌玫瑰红钠琼脂培养基大肠埃希菌曙红亚甲蓝琼脂培养基Page26四、方法的验证试验建立微生物限度检查法时，应先进行方法验证：确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌的菌落计数测定或控制菌的检查。选择法定试验菌按照规定的方法及要求进行。Page27五、药品的微生物限度检验方法（一）细菌、霉菌及酵母菌计数检测的是药物在单位质量或体积内所存在的活菌数量评价生产过程中原辅料、设备、器具、工艺、环境及操作者的卫生状况Page28五、药品的微生物限度检验方法（一）细菌、霉菌及酵母菌计数1.计数方法的验证用以保证方法中供试液没有抗菌活性、培养条件适宜细菌、霉菌及酵母菌生长、制备过程中稀释剂未受微生物干扰、供试液稀释级选择适宜。验证试验包括试验组、菌液组、供试品对照组及稀释剂对照组判断指标:各试验菌每次试验的菌数回收率Page29五、药品的微生物限度检验方法（一）细菌、霉菌及酵母菌计数2.供试品检查方法（1）平皿法根据菌数报告规则取相应稀释级的供试液1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入15～20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基（细菌）或玫瑰红钠琼脂培养基（霉菌）或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（酵母菌），混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备2个平板。平皿法以培养后细菌、霉菌或酵母菌在琼脂平板上形成的独立可见的菌落为计数依据，按照菌数报告规则进行报告。同时取试验用的稀释液1ml，同法操作，作为阴性对照试验。每种计数用的培养基各制备2个平板，均不得有菌生长。Page30营养琼脂培养基取相应稀释级的供试液1ml置无菌平皿中玫瑰红钠琼脂培养基阴性对照试验细菌、霉菌计数试验用的稀释液1mlPage31细菌、霉菌计数Page32五、药品的微生物限度检验方法（一）细菌、霉菌及酵母菌计数2.供试品检查方法（2）薄膜过滤法所用滤膜孔径不大于0.45μm，直径一般为50mm。取相当于每张滤膜含1g、1ml或10cm2供试品的供试液（或适宜稀释级的供试液1ml），加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。用pH7.0无菌冲洗液冲洗滤膜后，取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养，培养条件和计数方法同平皿法。每种培养基至少制备一张滤膜。根据菌数报告规定计数，如超过规定限量即可认定不合格。同时取试验用的稀释液1ml同法操作，作为阴性对照，阴性对照不得有菌生长。Page33五、药品的微生物限度检验方法（二）控制菌检查检查非规定灭菌制剂中是否存在有可疑的致病菌控制菌检查项目包括大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌及白色念珠菌。Page34五、药品的微生物限度检验方法（二）控制菌检查1.适用性检查适用性检查项目包括促生长能力、抑制能力及指示能力的检查促生长能力检查用以保证在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间内，试验菌生长良好（液体培养基）、菌落大小、形态特征与对照菌一致（固体培养基）抑制能力检查用以保证其他试验菌无法生长指示能力检查用以保证培养基上试验菌的生长情况（液体培养基）、菌落大小、形态特征（固体培养基）、指示剂反应情况等与对照培养基一致Page35五、药品的微生物限度检验方法（二）控制菌检查2.方法验证试验控制菌检查方法的验证试验用以保证方法中供试液没有抗菌活性、所采用方法适合于该产品的控制菌检查Page36五、药品的微生物限度检验方法（二）控制菌检查3.阳性对照试验和阴性对照试验试验菌的阳性对照试验：应检出相应的控制菌稀释液的阴性对照试验：应无菌生长Page37五、药品的微生物限度检验方法（二）控制菌检查4.控制菌检查法（1）大肠埃希菌检查法：取供试液在胆盐乳糖培养基的培养物0.2ml，接种至含5ml4-甲基伞形酮葡糖苷酸（MUG）培养基的试管内，培养，于5小时、24小时在366nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。Page38五、药品的微生物限度检验方法（二）控制菌检查4.控制菌检查法（2）大肠菌群在乳糖胆盐发酵培养基管中，分别加入1∶10、1∶100、1∶1000的供试液1ml，用稀释剂1ml作为阴性对照，均培养18～24小时，观察结果Page39五、药品的微生物限度检验方法（二）控制菌检查4.控制菌检查法（3）沙门菌检查法：取供试液在营养肉汤培养基中的培养物1ml，接种于10ml四硫磺酸钠亮绿培养基中，培养18～24小时后，划线接种于胆盐硫乳琼脂（或沙门、志贺菌属琼脂）培养基和麦康凯琼脂（或曙红亚甲蓝琼脂）培养基平板上，根据培养后平板上有无菌落生长、或生长的菌落形态特征，判断是否检出沙门菌。如菌落形态特征相符或疑似，还应通过用三糖铁琼脂培养基高层斜面进行斜面和高层穿刺接种试验