微生物限度检查法

微生物限度检查法江苏省苏州药品检验所细菌、霉菌（酵母菌）计数1简述（微生物限度检查的意义）细菌、霉菌、酵母菌计数是检测规定企业单位内的非灭菌制剂污染的活菌数量，是判定药品受到微生物污染程度的重要指标，也是对生产企业的药品、原料、辅料、设备器具、工艺流程、生产环境和操作者的卫生状况进行卫生学评价的综合依据之一。细菌、霉菌、酵母菌计数均采用平板菌落计数法，这是活菌计数方法之一，也是目前国际上许多国家常用的一种方法。该方法以在琼脂平板上，每个细菌（营养琼脂）、霉菌（玫瑰红钠琼脂）、酵母菌（玫瑰红钠琼脂或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂）形成一个独立可见的菌落为计数依据。测定结果只反映在规定条件下所生长的细菌（一群在营养琼脂上发育的嗜中温、需氧和兼性厌氧菌）、霉菌和酵母菌的菌落数。不包括对营养、氧气、温度、PH和其他因素有特殊要求的细菌、霉菌和酵母菌。一个细菌、霉菌和酵母菌菌落均可由一个或多个菌细胞形成。因此供试品中所测的菌落数实际为菌落形成单位数（colonyformingunit，CFU），而不应理解为细菌、霉菌、酵母菌的个数。微生物检验项目：细菌总数测定、霉菌与酵母菌总数测定、控制菌检验（包括大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、沙门菌、金黄葡萄球菌、破伤风梭菌）以及活螨的检验。2.1设备2.1.1无菌室2设备、仪器及用具2.1.1.1结构和要求无菌室应采光良好、避免潮湿、远离厕所及污染区（面积不超过10m2，高度不超过2.4m）由缓冲间（2个）、操作间组成。操作间与缓冲间之间应有样品传递箱，出入操作间和缓冲间的门不应直对。无菌室内应六面光滑平整，能耐受清洗消毒。墙与地面及墙壁、天花板连接处应呈凹弧形无缝隙，不留死角。操作间内不应安装下水道。无菌室内的照明灯应嵌装在天花板内，室内光照应分布均匀，光照度不低于300勒克斯。缓冲间和操作间均应设置紫外线杀菌灯（２～２.5W/m3），紫外杀菌灯应距实验台面高度不超过1M，并应定期检查辐射强度，不得低于70μW.cm-2（１M距离）。不符合要求的紫外杀菌灯应及时更换。2.1.1.2温度、湿度无菌室内温度和相对湿度直接影响紫外杀菌灯杀菌效果，故温度应控制在18～26℃，相对湿度40～60％。操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正压、不低于4.9Pa。2.1.1.3操作间操作间应安装空气除菌过滤层流装置。洁净度不应低于是10000级，局部净化度为100级，或放置同等级净化工作台，并准备药物天平，乙醇灯，火柴，乙醇棉，大、小橡皮乳头等。2.1.1.4缓冲间缓冲间内应有洗手盆，无菌衣、帽、口罩、拖鞋等。缓冲间内不应放置培养箱和其他杂物。2.1.1.5洁净级别及检查方法通常采用尘粒数及浮游菌数或沉降菌数测定法。洁净室（区）空气洁净度级别表洁净度级别尘粒最大允许数/立方米≥0.5μm≥5μm百级3，5000万级350，0002，000十万级3，500，00020，000三十万级10，500，00060，000级别微生物最大允许数换气次数/小时浮游菌/立方米沉降菌/皿百级510.3米/秒万级100320十万级5001015三十万级—15---2.1.1.5.1浮游菌数测试方法（参照中人民共和国国家标准GB/T16293-1996）。2.1.1.5.2沉降菌数测定(Ⅱ法)无菌室操作台消毒擦拭处理后，先启动层流净化装置30min，将备妥的营养琼脂平板3个(经30～35℃预培养48h，证明无菌落生长。)以无菌方式（或经传递箱）移入操作间，置净化台左、中、右各1个，开盖，暴露30min后将盖盖上。在30～35℃培养箱内倒置培养48h，取出检查。3个平板生长的平均菌落数不超过1个。无菌室操作台或净化工作台要定期检测其洁净度，应达到100级。净化工作台中的高效及中效过滤器应根据检测情况，必要时予以更换处理。2.1.1.6消毒处理无菌室应在每次操作前、后均用０.1%苯扎溴铵溶液或其他消毒液擦拭操作台及可能污染的死角。开动层流净化装置，同时用紫外杀菌灯照射30min。2.1.2其他设备、净化工作台、恒温培养箱（30～35℃）、生化培养箱（25～28℃），微波炉（或其他适宜加热装置）、康氏振荡器、匀浆仪（3000～8000r/min）、恒温水浴、电热干燥箱（250～300℃）、电冰箱、空调、高压蒸汽灭菌器（使用时要进行灭菌效果检查并应定期请有关部门检定）。2.2仪器及器皿2.2.1菌落计数器、显微镜（1500X）、电子天平或药物天平（感量0.1g），pH系列比色计。2.2.2玻璃器皿锥形瓶(250～300ml，内装玻璃珠若干)、研钵（陶瓷制，直径10～12cm）、培养皿(Ф9cm)、量筒(100ml)、试管(18×180mm)及塞、吸管(1ml分度0.01，10ml分度0.1)、注射器(20或是30ml)、注射针头、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸(带盖)。玻璃器皿用前应洗涤干净，无残留抗菌物质吸管口上端距0.5cm处塞入约2cm的适宜疏松棉花，置吸管桶内或牛皮纸袋中。锥形瓶、量筒、试管均应加棉塞或硅胶塞，再用牛皮纸包扎。玻璃器皿，均于160℃干热灭菌2h或高压蒸汽121℃灭菌30min，烘干备用。2.3用具2.3.1大、小橡皮乳头（放于干净带盖的容器中，并应定期用70%～75%乙醇溶液浸泡）。2.3.2无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后配套，用牛皮纸包严）灭菌，备用。也可用一次性无菌衣、帽、口罩、手套。2.3.3接种环(白铱金或镍铬合金，环径4～5mm、长度6～10cm)、乙醇灯、乙醇棉球或碘伏棉球、灭菌剪刀或灭菌手术刀和灭菌镊子、灭菌钢锥、灭菌称样纸、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、白瓷盘、洗手盆、陶瓦盖（12cm）、实验记录纸等。3试液3.1消毒液3.1.10.1%苯扎溴铵溶液（供洗手、擦拭操作台面用）。3.1.25%石碳酸溶液(配好后装入玻璃消毒缸内，供消毒带菌吸管用)亦可选用其他适宜消毒液。3.1.375%乙醇溶液3.1.4碘酊或碘伏溶液3.2稀释剂和试剂3.2.10.9%无菌氯化钠溶液(附录3.1)3.2.2无菌聚山梨酯-803.2.3无菌聚山梨酯-80氯化钠溶液(附录3.2)3.2.4无菌磷酸盐缓冲液(pH7.2)(附录3.3)3.2.5无菌0.1%氯化三苯四氮唑溶液(TTC)(附录2.15)4培养基4.1营养琼脂培养基(附录5.2)4.2玫瑰红钠琼脂培养基(附录5.3)4.3酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)琼脂培养基(附录5.4)培养基制备应注意：4.3.1采用干燥培养基，按说明配制，应对灭菌后的培养基pH值进行校验。若为自配培养基，原料应挑选，琼脂凝固力应测定，以确定配制时琼脂用量。试剂规格应为化学纯以上的试剂。4.3.2配制的培养基不应有沉淀，如有沉淀，应于溶化后趁热过滤，灭菌后使用。4.3.3培养基的分装量不得超过容器的确2/3，以免灭菌时溢出。包装时，塞子必须塞紧，以免松动或脱落造成染菌。4.3.4培养基配置后应在2h内灭菌，避免细菌繁殖。4.3.5灭菌后的培养基在冷暗处保存备用，放置时间不能过长，以免水分散失及染菌。已熔化的培养基应一次用完，开启后不宜再用。4.3.6勿用电炉直接熔化琼脂培养基，以免营养成份过度受热而破坏。应用水浴或微波炉加热。5供试品抽样、保存及检验量5.1抽样5.1.1一般采用随机抽样方法，抽样量应为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量（以备复试）。5.1.2抽样时，凡发现有异常或可疑的样品，应选取有疑问的样品，但机械损伤、明显破裂的包装不得作为样品。5.1.3凡能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、发霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格，无需再抽样检验。5.2保存5.2.1供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，勿冷藏或冷冻，以防供试品内污染菌因保存条件不妥引起致死，损伤或繁殖。5.2.2供试品在检验之前，应保持原包装状态，严禁开启。包装已开启的样品不得作为供试品。5.3检验量5.3.1所有剂型的检验量均需取2个以上包装单位（中药蜜丸、膜剂，需取自4丸、4片以上）。5.3.2固体及半固体(粘稠性供试品)制剂检验量为10g。5.3.3液体制剂检验量为10ml。5.3.4膜剂除另有规定外，中药膜剂检验量为30～50cm2，化学药及生化药膜剂检验量为10cm2。5.3.5特殊贵重或微量包装的药品，检验量可酌减。除另有规定外，口服固体制剂不低于3g。液体制剂采用原液者不得少于6ml，采用供试液者不得少3ml，外用药品不得少5g。6操作方法6.1试验前准备6.1.1将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、吸管（1ml、10ml）、量筒、稀释剂等移至无菌室内。每次试验所用物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作中出入操作间。编号后将全部外包装（牛皮纸）去掉。6.1.2开启无菌室紫外杀菌灯和空气过滤装置，并使其工作不低于30min。6.1.3操作人员用肥皂洗手，关闭紫外杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋。再用0.1%苯扎溴铵溶液或其他消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴无菌衣、帽、口罩、手套。6.1.4操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。6.2供试液的制备6.2.1液体供试品取供试品10ml，置灭菌锥形瓶中，加入90ml稀释剂，摇匀，作为1:10供试液。含王浆或蜂蜜的液体制剂和滴眼剂直接用供试品作为供试液。6.2.2固体、半固体或粘稠供试品称取供试品10g，置于匀浆杯或适当灭菌容器中，加入100ml0.9%无菌氯化钠溶液，用匀浆仪（3000～5000r/，2～4min），振荡器或乳钵研磨等方法分散混匀。胃溶胶囊加稀释剂后置45±1℃水浴中振摇，肠溶胶囊加无菌磷酸盐缓冲液后先打碎再置45℃±1℃水浴振摇溶解。6.2.3非水溶性供试品软膏剂、乳膏剂称供试品5g（5ml），加入含已灭菌溶化并保温45℃左右的司盘-805g、单硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯-8010g混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌均匀后，慢慢加入45℃左右的0.9%无菌氯化钠溶液85ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为供试液（1：20）。油剂取供试品10ml，加入无菌聚山梨酯-805～8ml，摇匀，再加入稀释剂至100ml。栓剂称取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加适量稀释剂，置45℃水浴保温10min，使溶，加入无菌聚山梨酯-805～8ml，振摇使之乳化，再加稀释剂（稀释剂和聚山梨酯-80总量为100ml），摇匀。6.2.4气雾剂将供试品置冰箱（4～８℃）１h，取出，用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭供试品开启部位周围，然后以无菌钢锥仔细钻孔并插入容器中，勿移出钢锥，以转动方式使容器内抛射剂全部抛出。以无菌注射器吸出全部药液，按标示量补加稀释剂至足量（若含非水溶性成份，加适量无菌聚山梨酯-80液）此液即为供试品原液。6.2.5膜剂中药膜剂一般取30～50cm2，将药膜剪成碎片，置灭菌锥形瓶中，加入稀释剂100ml，于45±1℃水浴保温，振摇使溶。西药药膜一般取样为10cm2，制备供试液方法同上。6.2.6茶剂取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加入稀释剂100ml，振摇30s，以灭菌纱布过滤（如为袋泡茶，可直接取2袋，以称样结果按1：10加稀释剂，浸泡30min）。以上供试品如吸水膨胀，或粘度过高，增加稀释剂，制成都是1：20～1：100供试液。6.3供试液的稀释（10倍递增稀释法）6.3.1取2～3支灭菌试管，分别加入9ml灭菌稀释剂（此时操作一般为：左手执试管并将塞打开，倾斜，右手执10ml吸管吸量，注意：勿在乙醇灯焰峰正上方操作，以免灯焰将供试液中菌细胞杀灭）。加完稀释剂后，试管塞应立即塞上。6.3.2另取1支1ml灭菌吸管吸1：10均匀供试液1ml，加入装有9ml灭菌稀释剂的试管中混匀，即为1：100供试液。以此类推，根据供试品污染程度，可稀释至1：1