Western-blot实验步骤详解PPT

Western详解及常见问题解答Will  Wang  Ph.D.  CellSignalingTechnology• Cell Signaling Technology, Inc. (CST) 是美国著名的生物公司和细胞信号转导研究的领导者，提供特色的用于信号转导研究的抗体、ELISA试剂盒、蛋白翻译后修饰组学服务等产品。 • CST拥有专业的生产和研发队伍，发表的文章多次收录在Nature、Cell、Science等杂志上。 • 其高质量的产品和专业的研发精神已被全球客户推崇为“细胞信号转导研究的金标准”！ CST抗体的特色 抗体验证：  1）蛋白表达水平上的验证 • 检测细胞系/组织样品中的特定目的蛋白表达的情况，以验证生产的抗体可以检测到内源蛋白的水平，以及抗体的种属反应性和特异性。 2）磷酸化的特异性验证 • 用抗体对磷酸酶处理和未处理的裂解物样品进行检测以确定磷酸化抗体的特异性。  3）各种生物因子处理验证 • 用生长因子、细胞因子以及激活或抑制剂处理细胞系样品，以检测所生产抗体是否识别特定的目的蛋白和相应的修饰状态的蛋白。 CST抗体的特色4）siRNA敲除实验 利用siRNA转染细胞样品，然后进行检测以验证抗体的特异性。  5）批次间的稳定性 所有新生产的抗体都同以往批次的抗体进行比较，以确保抗体表现的稳定性。 CST抗体的特色• 为了研发出一个单抗而进行------数以百计的western杂交实验 CST技术支持• CST为您提供卓越的客户服务和技术支持。研发和生产抗体的科学家会及时回答您的问题并帮您分析和解决遇到的实验问题 CST的学术资源 • 免费的蛋白质翻译后修饰数据库； • 激酶、组蛋白修饰、泛素连接酶及致癌基因等大量信息数据； • MIT Koch癌症信号通路研究论坛； • CST年度目录册与技术参考资料 Western 学术资源 Western 白皮书 Western 大电影 Western杂交实验要点与问题分析 Western杂交实验依据蛋白的大小，利用电流把细胞或组织中的蛋白分离开，并使用抗体来检测样品中目标蛋白的存在与否以及表达水平的高低。 Western 步骤概览 样品制备 上样与电泳 转膜 封闭 抗体孵育/检测 1. 样品制备 2. 上样与电泳 3. 转膜 4. 封闭 5. 抗体孵育和检测 掌控你的实验 1. 实验对照 • 任何一个实验中的重要考虑就是加入合适的对照。阳性和阴性参照可以确保你的抗体检测到信号的正确度。 对照细胞裂解物 掌控你的实验 2. Loading对照 • 当修饰状态特异的抗体用来检查某个蛋白的活化状态的变化时，那么就应当使用相应的总蛋白抗体以确保上样的一致和样品的完整性。 • 那些在不同细胞系和组织中表达很好的蛋白如beta-actin，alpha-tubulin和GAPDH经常被用于比较多个样品中总蛋白水平实验的loading对照。  Loading对照 样品类型 分子量（kDa） 注意 Beta Actin（#4970） 全细胞/细胞质 43 不适用于骨骼肌的样品。细胞生长条件的改变以及与胞外基质组分的相互作用都可能会导致actin蛋白合成的变化 GAPDH（#5174） 全细胞/细胞质 30-40 在某些生理条件下，如缺氧及糖尿病时，会导致在一些特定细胞类型中GAPDH的表达增加 Tubulin（#2128，#2125） 全细胞/细胞质 55 对抗微生物和抗有丝分裂药物耐受性的不同而会导致Tubulin的表达发生变化 VDAC1/Porin（#4661，#4866） 线粒体 31 COXIV（#4850，#11967） 线粒体 16 Lamin B1（#12856） 核内 66 不适合于移除核被膜的样品 TATA 结合蛋白TBP（#12758） 核内 38 不适合于移除DNA的样品 掌控你的实验 3.   细胞特定组分marker • 当你正在制备细胞核与细胞质抽提物时，应当使用细胞分离marker以确保正确的得到了裂解物。  样品制备 1. 样品制备 2. 上样与电泳 3. 转膜 4. 封闭 5. 抗体孵育和检测 1. 样品制备1）裂解液      裂解缓冲液里含有不同浓度的变性剂，盐，酶抑制剂（如磷酸酶抑制剂或蛋白酶抑制剂），这些试剂用于分离细胞，溶解蛋白，防止降解。     • Cell Lysis Buffer (10X) #9803：       -----适用在非变性条件下对细胞进行裂解； • Chaps Cell Extract Buffer (10X) #9852：       -----适用与在非变性条件下对细胞进行裂解，推荐用于利用CST的Caspase信号通路抗体进行检测的细胞质细胞裂解物的制备； • RIPA Buffer (10X) #9806       -----用于细胞和组织的裂解； 目标蛋白 裂解缓冲液 全细胞 普通细胞裂解缓冲液 #9803或 #9852 膜结合的 RIPA裂解液 #9806 或普通细胞裂解缓冲液#9803 核内蛋白 RIPA裂解液 #9806 线粒体蛋白 RIPA裂解液 #9806 1. 样品制备2）蛋白酶和磷酸酶抑制剂       • PMSF#8553；• ProteaseInhibitorCocktail(100X)#5871-----AEBSF,Aprotinin,Bestatin,E64,Leupeptin,PepstatinA；• PhosphataseInhibitorCocktail(100X)#5870；-----Sodiumfluoride,sodiumpyrophosphate,β-glycerophosphate,sodiumorthovanadate；• Protease/PhosphataseInhibitorCocktail(100X)#5872-----上述蛋白酶和磷酸酶抑制剂的混合； 抑制剂 所抑制的蛋白酶/磷酸酶 裂解缓冲液中的终浓度 Aprotinin 胰酶，糜蛋白酶，血浆酶 2 ug/ml Leupeptin 溶酶体中的相关酶 1--10 ug/ml Pepstatin A 天冬氨酸蛋白酶 1 ug/ml PMSF 天冬氨酸蛋白酶 1 mM EDTA 需要镁和锰离子的金属蛋白酶 1--5 mM EGTA 需要钙离子的金属蛋白酶 1 mM Na Fluoride 丝氨酸和苏氨酸磷酸酶 5--10 mM Orthovanadate 酪氨酸磷酸酶 1 mM Pyrophosphate  丝氨酸和苏氨酸磷酸酶 1--2 mM β-glycerophosphate  丝氨酸和苏氨酸磷酸酶 1--2 mM 1. 样品制备3）从细胞或组织里提取裂解物 I. 确保样品完全裂解 • 建议在裂解细胞时加入超声处理，以确保样品充分裂解和断裂DNA；超声加上化学裂解能得到非常好的效果； • 对于组织样品，使用刀浆的步骤；利用变性程度更强的RIPA缓冲液会更彻底和稳定的裂解组织；  67Lackofsignalbecausetheconcentrationoftheproteinofinterestisbelowdetectablelevels.Ifthisisduetominimalexpressioninthestartingcelllineortissuesample,chemicalstimulationtoinduceexpressionmaybeneededoranalternatecellline,expressinghigherlevels,maybeconsideredifpossible.Ageneexpressiondatabaseshouldbeconsultedtoestimateproteinexpressionlevelsinspecificcelllinesandtissues.TROUBLESHOOTINGTIPLysatePreparationEnsuringCompleteLysisandUsingFreshSamplesTopreparesamplesforanalysis,itisrecommendedthatchemicalandphysicalmethodsareusedtodisruptmembranesandensurecelllysisandthereleaseofproteinsofinterest.Forsamplelysatesfromtissues,ahomogenizationstepisrecommendedinmostcases,andaproteaseinhibitorcocktailisusuallyaddedtothelysisbufferpriortohomogenization.Lysisbufferscontainvaryingdegreesofdetergents,salts,andenzymaticinhibitors(suchasphosphataseorproteaseinhibitors(A))tobreakapartcells,solubilizeproteins,andpreventdegradation.Shownherearetheeffectsofsonicationinconjunctionwithchemicalcelllysis.Werecommendsonicationofcellandtissueextractsingeneral,butitiscrucialforthestudyofnuclearandchromatinassociatedproteinssuchasHistoneH3.Here(B)weobserveagreatlyenhancedsignalinsonicatedcomparedtononsonicatedextracts.Thisisbecausesonicationdisruptsmembranesandchromatintoagreaterextentthanlysisbufferalone.WealwaysrecommendsonicationtoensuretotalcelllysisandtoSHEARTHECHROMOSOMAL$.!7ERECOMMENDPULSESFORSECONDSATnpower,thoughitisimportanttorememberthatdifferentsonicatorsperformdifferentlyandshouldbeindividuallyoptimizedpermanufacturer’srecommendations.Allow10secondsbetweenpulsesandkeepsamplesonicewhilesonicating.Ifyoudonothaveaccesstoaprobesonicator,passingyoursamplesthroughafinegaugeneedleWILLALSOSERVETOBREAKMEMBRANESANDSHE