质粒DNA的提取、酶切及其琼脂糖凝胶电泳实验报告

实验序号实验名称质粒DNA的提取、酶切及其琼脂糖凝胶电泳实验时间是否小组合作是（√）否（）一．实验预习1．实验目的：（1）通过本次实验学习和掌握碱裂解法提取质粒；（2）通过本次实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术；2．实验原理：1）质粒DNA的提取：（1）关于质粒：质粒是一类存在于几乎所有细菌中染色体之外（细胞质中）呈游离状态的双链、闭环的DNA分子。质粒通常携带有染色体上所不存在的能够表达产生抗生素、耐受重金属等重要性状的基因。细菌质粒的大小范围从1kb至200kb以上不等，且拥有自己的复制起始位点，可不依赖于染色体而进行独立自主复制。一些小的质粒利用宿主细胞的酶进行复制，而较大的质粒则自身携有复制与编码的有关酶。（2）一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤：①培养细菌，使质粒DNA大量扩增；②收集和裂解细菌；③分离和纯化质粒DNA。分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。（3）碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的原理：碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确；而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，因复性较缓慢且不准确而相互缠绕形成不溶性网状结构。而复性的质粒DNA恢复原来构型，保持可溶性状态。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，最后用酚氯仿可以抽提纯化上清液中的质粒DNA。2）质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳：（1）关于电泳技术：电泳常用于分离和纯化那些分子大小、电荷性状或分个构象有所不同的生物大分子——尤其是蛋白质和核酸。正因为如此，电泳已成为生物化学和分子生物学中应用最为广泛的技术之一，其中在分子生物学实验中最为常用的是琼脂糖凝胶电泳。琼脂糖是一种海藻多糖，琼脂糖胶分离范围很大，但其分辨率却相对较低。通过改变琼脂糖凝胶的浓度，应用标准的电泳技术可以分离200到50,000bp大小的DNA片断。一般琼脂糖胶浓度在0.5％到4％之间，且琼脂糖凝胶浓度越大，凝胶就越硬。较高浓度的琼脂糖胶有利于较小的DNA片断分离，而较低浓度的琼脂糖胶则可以分离较大的DNA片断。（2）琼脂糖凝胶电泳条带的观察：通过观察示踪染料的迁移距离可以判断DNA的迁移距离。溴酚蓝染料在琼脂糖凝胶的迁移速率大小与300和4000bp大小的双链DNA片断相同。当迁移足够距离后，就可以通过Gelview染色来观察DNA片断。Gelview是一种荧光染料。它可以在做胶时混入其中在电泳时进行染色，也可以待电泳完成后将凝胶浸泡在稀释的Gelview溶液中进行染色。但必须将凝胶置于紫外透射仪中才可以对凝胶中的DNA或RNA进行观察。（3）质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳分离：DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液环境中带负电荷，在电场中向正极移动，由于磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以相同的速度向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的构型和大小。具有不同分子质量或者不同构型的DNA分子泳动速率不一样，可以进行分离。未切割的质粒DNA在其泳道上也许会出现几个条带，之所以这样是由于质粒DNA在琼脂糖凝胶中的迁移距离是由其分子构象及其碱基对大小所决定的。质粒DNA以下列三种主要构象中的任何一种形式存在：①超螺旋DNA：尽管质粒通常以开环的形式进行描述，然而在细菌细胞内DNA链即是盘绕在组蛋白周围形成一种致密的结构。这就是所谓超螺旋结构，由于其结构致密，它在凝胶中的泳动速度最快。②线性DNA：当DNA损伤在DNA双链相对应的两条链上同时产生切口时，就会出现线性质粒DNA，这种DNA的泳动速率介于超螺旋与切口质粒DNA之间。③开环DNA：在质粒DNA复制过程中，拓扑异构酶I会在DNA双螺旋中的一条链中引入一个切口，解开质粒的超螺旋。在质粒分离过程中由于物理剪切和酶的切割作用同样也会在超螺旋质粒中引入切口从而产生松散的开环结构。这种形式的质粒迁移速率最慢，其“松散”的分子形式阻碍了它在琼脂糖凝胶中的运动。3．实验器材：（1）实验仪器（apparatus）：恒温培养箱（Constanttemperatureincubator）、恒温摇床（Constanttemperatureshakingtable）、高速离心机（Highspeedcentrifuge）、漩涡振荡器（Vortexmixer）、超净工作台（Bechtop）、高压灭菌锅（Autoclave）、微量加样器（Pipettes）、烧杯（beaker）、量筒（graduatedcylinder）、玻璃棒（stirbar）、微波炉（microwave）、天平（Panbalance）、电泳梳子（comb）、电泳槽（electrophoresistank）、电泳器（Electro-phoresisSystem）、紫外灯（Ultraviolettransilluminator）3）、材料与试剂（Reagents）：①溶液I（SolutionⅠ）：50mmol/L葡萄糖；25mmol/L三羟基甲基氨基甲烷（Tris）Tris-HCl（pH8.0）；10mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）pH8.0溶液I可成批配制，每瓶约100ml，10磅高压蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。②溶液Ⅱ（SolutionⅡ）：新鲜配制，等体积混合0.2mol/LNaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）；1%SDS（可用10％贮存液稀释配制）注意：SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌。③溶液III（SolutionⅢ，100mL)：加上后混匀会形成絮状沉淀60mL5mol/LKAc，11.5mL冰醋酸，28.5mLH2O（该溶液钾离子浓度为3mol/L，醋酸根离子浓度为5mol/L）④TE液缓冲液：10mmol/LTris-HCl（pH8.0）；1mmol/LEDTA（pH8.0）⑤70%乙醇；⑥平衡酚：氯仿1：1：将量取25mlTris-HCl（pH8.0）平衡苯酚，加入24ml氯仿和1ml异戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4℃保存。⑦LB培养基：胰化蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl15gpH7.0⑧琼脂糖（Agarose）；⑨1liter（升）5×TBE备用溶液（stocksolution）：54gtrisbase，27.5g硼酸（boricacid），20ml0.5mol/LEDTA,pH8.0；⑩6×凝胶加样缓冲液：0.25%溴酚蓝（bromophenolblue），40%蔗糖（sucroseinwater）；另外还有的试剂是：胰RNA酶、DNAMarker、硼酸、Gelview试剂（2）实验材料：含有pUC19质粒的大肠杆菌等。4．实验方法步骤及注意事项1）实验方法步骤第一部分：质粒DNA的提取及酶切（1）取1.4ml含pUC19这里的大肠杆菌培养物于1.5ml微量离心管中，4000r/min离心2分钟，吸去上清液，并使细胞沉淀尽可能干燥；（2）加100l溶液Ⅰ悬浮细菌沉淀，充分混和均匀，室温放置10min；（3）加200l溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管口，轻缓上下4-6次颠倒离心管以混合内容物。将离心管静置冰上5min（使溶液变透明，粘稠）；（4）加200l溶液Ⅲ（事先冰上预冷），盖紧离心管口后上下轻缓颠倒4-6次，置冰上15min(溶液出现白色沉淀)；（5）12000rpm离心15min，转移上清液至另一离心管（弃沉淀）；（6）向上清液中加入等体积的酚：氯仿（1：1），反复混匀，12000rpm离心5min，取上清液移至另一离心管中；（7）加2倍体积无水乙醇，振荡混匀，静置10min，12000rpm离心5－10min。弃上清液，将离心管倒置于吸水纸，将附于管壁的残余液滴除净。（8）加200l70％乙醇洗涤沉淀物，12000rpm离心2min，弃上清液，将沉淀在室温下晾干（或在50℃－60℃的烘箱中也可）。（9）沉淀加20μlTE,反复吹打使质粒DNA充分溶解，－20℃保存。第二部分：质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳Ⅰ.凝胶的制备（Preparationofthegel）（1）制备1％琼脂糖凝胶：称取0.5g琼脂糖，放人锥形瓶中，加入50mL的0.5×TBE缓冲液，放入微波炉加热至完全溶化，则为0.5％琼脂糖凝胶液（由于蒸发作用，溶解前在容量瓶上作一个记号，溶解后用三蒸水补足）；(2）制胶器的安装：①取多功能制胶器，洗净，晾干；②将多功能制胶器放置于一水平位置，选择12×6cm制胶架，然后选择1.5mm18teeth的梳子（最大加样量25µl）；③将所选择规格的梳子插入制胶架的定位槽中；（3）将熔化的琼脂糖凝胶液转入Gelview专用的三角瓶中，然后加入Gelview5µl；（4）将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入所选择的制胶槽内，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)；（5）待胶凝固后（30-60min），轻轻拔掉梳子，将凝胶盘从制胶槽中取出，放入电泳槽内；（6）加入电泳缓冲液(0.5×）至电泳槽中；Ⅱ.加样(LoadingDNAsamples)：用移液枪缓慢将DNA样品及其经过酶切的质粒DNA样品垂直加入加样孔直至开口下方（记录点样顺序，以便作为对照和分析），各加样量如下：DNAsamples：15µl酶切的DNA样品：3µlLoadingbuffer：2µlDNAmarkers：6µl（DNAsamples与Loadingbuffer总共加入20µl）Ⅲ.电泳（Gel）：（1）接通电泳槽与电泳仪的电源(注意正负极，DNA片段从负极向正极移动)。保持电压120V；（2）当溴酚蓝染料移动到凝胶总长度一半处时，停止电泳；Ⅳ.GelInterpretation（凝胶图像解释）：将电泳后的凝胶放在紫外灯的照射下进行DNA电泳条带的观察，并用凝胶电泳成像系统进行拍照、分析。2）注意事项（1）加溶液I后，必须要将菌体悬浮彻底，不得有块状或大颗粒状呈现，是质粒DNA提取的首要关键；（2）TAE和TBE均为常用的缓冲液。TBE比TAE有相对高的缓冲能力。（3）加样染料溴酚蓝可与长度约为0.5kb的DNA一起迁移，可用于指示迁移率最高的片段。（4）DNA的迁移速率取决于以下因素:①DNA的分子大小—分子量越小，迁移越快。②琼脂糖浓度—浓度越低，迁移越快。③DNA的构象—环状的或带切口环状的DNA通常比线状的DNA迁移要快。④两个电极之间单位厘米的电压——电压越高，迁移越快。（5）如果DNA条带不够窄且不够均匀，可能是内以下原因所引起：①DNA过载②电压过高③加样孔破损④凝胶中有气泡（6）在紫外灯下观察凝胶电泳所得结果应该戴上防护眼镜，因为紫外线对眼睛有伤害作用；二．实验内容1．实验现象与结果：将电泳后的凝胶放在紫外灯的照射下观察到的和用凝胶电泳成像系统进行拍照得到的DNA电泳条带图如下所示意：图注：x’：代表经过酶切的质粒DNA样品的电泳条带；x：代表未经过酶切的质粒DNA样品的电泳条带（x相同的互为对照组）；marker:DNA相对分子质量标准物。pUC19质粒DNA标准参照条带图像：2．对实验现象、实验结果的分析及其结论：（1）对实验现象的分析及其结论：从上述所示的DNA电泳条带图可以看出：不管在DNASample中还是在经过酶切处理后的DNA样品中均具有电泳迁移速率处于中间的线性质粒DNA。而在此次试验中出