银杏中黄酮的提取分离纯化

银杏中黄酮的提取分离纯化一、综述银杏树具有观赏、经济、食用、药用等价值，银杏叶含多种活性成分，包括黄酮、萜类、内酯、聚戍烯醇、生物碱、术酯体等，在药用方面，银杏叶提取物的有效成分主要是黄酮苷类和萜类物质，有通过降低血液黏弹性改善微循环系统的功能，银杏叶中黄酮类化合物的含量较高，主要有黄酮及其苷、双黄酮、儿茶素这三类物质。其中黄酮及其苷类化合物大多数是由槲皮素、山萘醇及其苷组成。黄酮类化合物主要是指母核为2-苯基色原酮的一类化合物，现在则泛指具有C6-C3-C6基本结构骨架的一大类天然化合物。天然黄酮类化合物母核上常含一些助色团，使该类化合物多显黄色，又因为分子中γ-吡酮环上的氧原子能与强酸成盐而表现为弱碱性，因此称为黄碱素类化合物。黄酮类化合物不仅来源广泛而且表现出多种多样的药理活性,具有对免疫系统作用、防癌抗癌作用、抗肿瘤作用、抗心血管疾病作用、对内分泌系统的作用、消除自由基和抗氧化活性。二、实验依据1、黄酮类化合物的分析方法①分光光度法该法是测定黄酮类化合物含量最为普遍的一种分析方法。；黄酮类化合物可与氯化铝、硝酸铝、氢氧化钾等形成稳定的络合物,并产生特征吸收光谱，通常采用硝酸铝比色法,黄酮类化合物与Al(NO3)3进行络合显色，测定其含量[33]。②高效液相色谱法高效液相色谱的固定相有硅胶柱和氨基柱，C18在黄酮类化合物的分析过程中应用广泛，在检测器的选择中，紫外检测仍是最普遍的检测方法，此外还有电化学检测器、光电二极管阵列检测器、蒸发光散射检测器等2、黄酮类化合物提取方法①有机溶剂提取法最常用的黄酮类化合物提取溶剂为乙醇和甲醇，高浓度的醇(如90%～95%)有利于于提取苷元，浓度为60%的乙醇或甲醇水溶液适则有利于于提取苷类物质；乙酸乙酯和丙酮也常用来提取黄酮类化合物。②水浸提法随着黄酮类提取物在市场上销售价格的降低，对于提取剂的选择，首先要考虑其成本问题，显然水浸提法对于降低成本，提高产品的市场竞争力有很大的帮助，而且就环保的角度出发，水浸提法更加环保、安全。由于大多数黄酮类化合物含有酚羟基显弱酸性，故而一般选择碱水进行提取，戴余军等研究了NaOH溶液提取银杏叶总黄酮，不同的NaOH溶液浓度对黄酮提取有显著影响，用50倍(V/W)0.25%的NaOH溶液70℃提取2次银杏叶总黄酮提取率可达1.264%；刘金香等用碱溶酸沉法提取银杏叶总黄酮，碱法提取95℃用40倍量pH=l0.0的NaOH溶液提取60min，然后用pH=3.5的HCl酸沉，得到黄酮提取率较单一用碱水提取有所上升。③超临界流体萃取法付桂明等对用杜仲叶提取总黄酮的工艺进行了优化，采用超临界CO2流体提取实验最佳提取工艺条件为：提取时间2.5h，提取温度35℃，夹带剂用量4.5ml/g，提取压力28MPa。④微波提取法李娜等用微波提取工艺提取苦丁茶冬青叶总黄酮，得到最佳提取条件为微波功率640W，微波时间70s，料液比1∶25，乙醇浓度60%，总黄酮提取率为33.67mg/g；此外，黄酮类化合物的提取方法还有酶辅助提取法，利用酶技术处理细胞壁，破坏其纤维组织来提高黄酮的提取率，，吴梅林等用酶活力为15000U/g的纤维素酶与银杏3、黄酮类化合物分离纯化方法黄酮类化合物的分离纯化方法主要有树脂柱层析法、大孔树脂吸附法、重结晶法、铅盐沉淀法等多种方法。①柱层析法柱层析技术又称柱色谱技术，目前较为常用的柱层析法主要有聚酰胺柱层析法，王怡红等将β-萘酚橙水溶液加入聚酰胺填料中，制备改性聚酰胺柱并用其分离纯化银杏叶提取物，使得银杏黄酮提取量大为提高。；硅胶柱层析法，对于黄酮类物质，硅胶对黄酮有很强的吸附能力，吸附后难以洗脱，因此，适用于极性较小的黄酮类物质的分离。；此外，硅胶柱层析法多与大孔树脂吸附法、薄层色谱法等联合使用与黄酮的分离纯化中所得产物纯度较高，此外还有葡萄糖凝胶柱层析法等多种柱层析法。②大孔树脂吸附法大孔吸附树脂其有良好的打孔网状结构和比表面积，对有机物的选择性较好,不受无机盐类及强离子低分子化合物存在的影响，如贝伟剑等用AB-8大孔吸附树脂树对柿叶黄酮富集和分离提纯，提取物中富集制备柿叶黄酮含量达70%以上；③分子印记技术分子印记技术一般用于黄酮类物质的进一步纯化使用，如向文艺[76]等用膜分离技术对黄酮粗产品进行初步的纯化后再用分子印记聚合物进一步精制提纯，料液中黄酮质量分数为72%，三、技术路线采用芦丁为标准物质，紫外分光光度法、溴量法测定黄酮的含量，选用工业酒精回流提取银杏黄酮，选择大孔吸附树脂HPD-100。1、标准曲线的绘制在酸性条件下，最大吸收波长在λ=352nm处，线性回归方程为：A=0.0195c-0.0065，线性相关系数R=0.9991；该方法简单方便，可快速测定出银杏叶中黄酮的含量，且根据测定精密度和准确度均符合要求。溴量法主要用于测定芳香胺类和酚类有机化合物含量，根据苯环上有羟基和氨基，邻位和对位氢易溴代反应，而黄酮的结构中含有多个酚羟基和活泼的双键，可以与溴发生取代反应和加成反应，如能根据以上性质，确定出黄酮与溴的反应系数，即可以将此方法运用于黄酮测定的定量分析中。紫外分光光度法和溴量法测得的值有一些偏差，但偏差不大，这主要是由于紫外分光度法适宜于微量的测定，需要稀释后测，溴量法适宜于较大剂量的测定，不需要稀释，；该方法操作简单，在一般实验条件下即可操作，不需要依靠大型仪器，适宜于大浓度黄酮的测定。因此在后续实验中，需考虑测定黄酮含量进而选择合适的分析方法。2、实验流程新鲜银杏叶洗净、阴干至恒重、粉碎过筛，准确称取10g处理好的银杏叶于250mL圆底烧瓶中，加入50mL工业酒精，在恒温水浴锅中，60℃下，回流90min，倾倒出滤液，；再加入50mL工业酒精，重复上述步骤三次，合并四次的提取液，在回流提取装置上浓缩至200mL备用。取上述浓缩后的提取液于分液漏斗中，加入等量的石油醚，震荡5min后，静置一段时间后弃去上层石油醚相，重复上述步奏三次后，醚相无色，则提取液中的大部分脂溶性杂质（如叶黄素、叶绿素）得以去除。HPD-100大孔吸附树脂的预处理。称取处理后的树脂以湿法装柱，柱高15cm，将经过石油醚处理后的银杏叶提取液以3mL/min的流速通过树脂柱，使树脂柱对提取液中的黄酮进行吸附，树脂静态吸附时间应该不低于150min。后以蒸馏水洗柱使附着在树脂柱内的水溶性杂质得以去除；然后用60%的工业酒精溶液对树脂柱进行洗脱，解吸液为体积分率为50%的工业酒精50mL，接收洗脱液。将经过树脂纯化后的含银杏黄酮的溶液进行蒸馏、浓缩，提取液中黄酮含量为503.8μg/mL，总收率为75.57%。浓缩液冷却至室温后放置在通风橱中让浓缩液中剩余的溶液挥发后得到银杏黄酮的提取物，进行研磨，得到粉末状银杏黄酮。四、分析验证1、产物结构的表征①红外光谱法在3415cm-1处有一宽而强的吸收峰，这是化学键—OH伸缩振动峰，在3003cm-1处有一弱的震动峰，是由化学键—CH反对称伸缩振动引起的，在1600～600cm-1处，吸收峰比较密集，且具有各自专属性指纹特征；对比分离纯化得到的黄酮产物，与标准品图谱基本一致，但吸收峰数目增多且有些峰顶端分裂为2个小峰，说明纯化产物中还存在一些杂质，同时分离纯化过程中分离方法对产物结构有一定的影响。②紫外吸收光谱法在350nm左右处出现特征吸收峰，与黄酮标准品的紫外吸收图谱对比，最大吸收峰峰型相似且位置相同，说明分离纯化后得到银杏黄酮产物2、产物纯度的表征采用高效液相色谱法检测树脂纯化后样品中黄酮的含量，其中色谱条件为：固定相：C18(250X4.6mrn，5pl)，流动相：甲醇-0.4%磷酸溶液（55：45），流速：lml/min，柱温：室温(25℃)，检测器：UV检测，波长：352nm，标准品：芦丁(浓度10pg/mL)，进样量：10μL参考文献陈平平.银杏的科学价值[J].生物学通报.1996.11:31–32张静.银杏黄酮纯化及生物活性研究[D].无锡.江南大学,2010柳闽生,陈晔,徐常龙.银杏叶有效成分的研究与资源的开发利用[J].江西林业科技,2000(2):28–29