乙肝病毒耐药基因测序

乙肝病毒耐药基因测序的临床应用◆DNA测序技术原理◆乙肝耐药基因测序特点◆耐药基因测序的应用DNA测序技术原理乙肝病毒结构美国ABI3130型基因测序仪本实验采用核酸扩增技术结合荧光标记探针杂交方法对乙型肝炎病毒DNA进行定量检测，其产物经过测序PCR反应，产物纯化后上3130测序仪进行毛细管电泳，得到测序峰图，从而完成耐药突变位点的检测。•HBVDNA的提取•定量PCR反应（HBVDNA≥5×103IU/ml的标本可以进行测序）•PCR产物的酶解（SAP酶混合物）•测序PCR反应（双脱氧终止法）•测序产物纯化（乙醇纯化法）•上机测序（毛细管电泳）•测序峰图分析乙肝病毒P区耐药基因测序步骤双脱氧终止法原理病毒DNA定量分析得到HBVDNA≥5×103IU/ml的标本可以进行后续的耐药基因测序，定量PCR产物经过SAPMIX的纯化后，进行测序PCR反应。普通PCR与测序PCR反应的比较普通PCR测序PCR反应（双脱氧终止法）DNA聚合酶Taq酶测序酶引物一对单向底物dNTPdNTP+ddNTP(带荧光标记)产物等长的DNA片段相差一个碱基的一系列片段荧光标记无3’端带荧光标记SAPMIX的作用外切酶ExonI降解定量PCR产物中残留的单链PCR引物。SAP酶除去定量PCR产物中残存的脱氧核苷三磷酸的磷酸基团，从而达到纯化定量PCR产物的目的。经过SAPMIX酶解纯化后的定量产物方可以进行后面的测序PCR反应。测序PCR循环条件96℃1min→(96℃10sec,50℃5sec,60℃4min)×25cycles→4℃恒温。60℃4min的延伸时间是与普通PCR最大差别，目的是为了扩增出一系列相差一个碱基的ddNTP末端终止的DNA序列。测序反应得到的产物经过酒精纯化，甲酰胺变性之后，可以上机进行毛细管电泳。酒精纯化的目的是去除未结合的荧光染料终止物和残留的引物、盐离子、酶等。此步对测序成功非常关键，关系到测序峰图质量的好坏。毛细管电泳原理一、电进样与电泳毛细管和电极深入样品溶液中，加电压，荷负电的DNA分子进入毛细管，在电场作用下向阳极泳动。二、荧光激发和检测带4色荧光标记的DNA片段按分子量从小到大依次经过激光检测区，激光激发荧光，产生长波长的荧光信号，荧光信号被CCD收集，软件将光学信号转换成电泳图谱。HBV野生型质控的测序峰图↑↑↑↑173位点180位点181位点184位点↑↑↑↑↑↑202位点204位点207位点213位点214位点215位点↑↑↑236位点237位点238位点↑250位点rtM204V/I/S的几种基因型↑204位点（YMDD）↑204位点（YVDD）↑204位点（YIDD）耐药突变位点命名•命名体系将HBV聚合酶蛋白划分成4个区域：终蛋白区、间蛋白区、rt区和RNA酶区，每个区的氨基酸分别计算位码。rt区起始于高度保守的EDWGPCDEHG位点，包含344个氨基酸，拉米夫定治疗相关的变异主要发生在该区，包括rtL180M和rtM204V/I等。新命名体系包括4个部分，即所属区域、治疗前氨基酸、变异位码和变异氨基酸，如rtL180M表示变异发生在rt区的180位点，亮氨酸（L）被蛋氨酸（M）所取代。应当指出的是，发生变异不一定耐药，只有当变异株成为优势株时才发生耐药。•本资料来源于网址：上海申友乙肝病毒DNA测序试剂盒检测的耐药位点拉米夫定（LAM）阿德福韦（ADV）恩替卡韦（ETV)替比夫定（LDT)rtV173LrtL180MrtM204V/I/SrtV207I/L/GrtS213TrtA181V/T/SrtV214ArtQ215SrtN236TrtP237HrtN/H238T/DrtT184A/I/SrtS202G/IrtM204V/I/SrtM250L/VrtL180MrtM204V/I/S复制DNA序列于NCBI基因分型网页上，就可得到乙肝病毒基因分型结果。乙肝耐药基因测序特点基因芯片和基因测序方法检测乙肝耐药位点的比较基因芯片基因测序原理标本DNA与耐药检测探针的DNA杂交双脱氧终止法检测基因序列结果分析由显色结果判断野生株与突变株由碱基序列与氨基酸序列判断相较于基因芯片检测，基因测序法具有直观，准确的优点，也避免了DNA杂交可能发生的污染，假阴性，假阳性问题。对于杂合子，也就是野生型与突变型共存的状况，更直观可靠。↑204位点由上图204位点可见，存在GTG、ATG、ATT三种碱基排列状况，分别对应V、M、I三种氨基酸，为YMDD/YVDD/YIDD杂合子，测序结果直观可靠。↑204位点由上图204位点可见，有GTG弱势突变株存在，属于YVDD与野生型共存的状况，基因测序可以较早发现突变株的存在。乙肝病毒耐药位点检测的临床应用HBV拉米夫定耐药使用一年、二年、三年、四年的耐药比率为：15-32%、38%、56%、67%虽然拉米夫定治疗慢性乙肝疗效显著，但长期使用拉米夫定会出现耐药现象一旦出现拉米夫定耐药突变（YMDD变异），大多数患者会在2-4个月之内出现HBV-DNA和ALT反弹HBV阿德福韦耐药•阿德福韦为5’-单磷酸脱氧阿糖腺苷类似物，可明显抑制HBVDNA复制•HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者，1、2、3年时的耐药发生率分别为0%、1.6%、3.1%•HBeAg阴性者1、2、3年的耐药发生率分别为0%、3.0%、5.9%~11%HBV恩替卡韦耐药•拉米夫定耐药的病毒株对恩替卡韦敏感性降低8至30倍；•发生YMDD变异患者治疗1年时对恩替卡韦耐药发生率为5.8%，并出现相关的位点变异。乙肝治疗的耐药管理•耐药也是一个“进化升级”的过程，从初级的“基因变异”，逐渐演变成中级的“病毒学耐药”，最终修炼成了的“临床耐药”。•“基因耐药”是指在抗病毒治疗过程中体内乙肝病毒基因组产生了变异，形成新的耐药性病毒基因序列。在这个初级阶段，变异病毒株在人体内的含量很少，还属于毫不起眼的“少数派”。由于它们数量稀少、势力低微，只能通过病毒基因检测才能发现他们的存在。•从“基因耐药”阶段跨入“病毒学耐药”阶段的过程中，变异病毒株会持续不断地进行自我复制，导致血清中HBVDNA水平反弹至1×103～1×106拷贝/毫升之间，这时尚未造成肝功能异常和明显的肝脏组织学损伤。•当变异株最终推翻了野生株的统治成功当家作主后，耐药发展到了“临床耐药”阶段。这时候，乙肝病人血液中的HBVDNA水平会反弹升至1×106拷贝/毫升以上，最终出现肝功能异常、肝脏组织学损伤。•因此，我们在“病毒学耐药”阶段及“基因耐药”阶段就应该尽早进行干预，及时阻止“病毒学耐药”朝“临床耐药”的恶性方向发展。•对于HBVDNA定量大于等于5×103IU/ml的标本，可以通过基因测序的方法检测耐药位点是否发生突变，从而及时进行耐药管理，指导用药。•对所有接受核苷类药物治疗的慢性乙型肝炎患者，治疗期间都应密切监测病毒学应答与突破，停药以后也应监测应答持续和病情复发情况•对初治无应答的患者，应考虑替换治疗以获得临床应答，尽可能减少后续耐药。对发生病毒学突破的患者，应考虑其依从性，同时尽可能进行病毒耐药突变的检测，以确定基因型耐药的存在和病毒耐药突变的模式。目前越来越多的患者接受一种以上药物治疗，对病毒耐药突变的检测显得尤其重要。以上位点，现有测序试剂盒都可以检测。拉米夫定（LAM）阿德福韦（ADV）恩替卡韦（ETV)替比夫定（LDT)rtV173LrtL180MrtM204V/I/SrtV207I/L/GrtS213TrtA181V/T/SrtV214ArtQ215SrtN236TrtP237HrtN/H238T/DrtT184A/I/SrtS202G/IrtM204V/I/SrtM250L/VrtL180MrtM204V/I/S目前常用的治疗乙肝口服抗病毒核苷类似物药物有：拉米夫定、替比夫定、阿德福韦、恩替卡韦四种。但是由于乙型肝炎病毒具有较高的突变性，一旦乙肝病毒发生耐药突变，将会导致上述药物治疗无效。研究结果显示，病人在治疗前就携带有拉米夫定耐药基因的有约26.41%，携带有阿德福韦耐药基因的有约6.52%。如果治疗之前就已经携带有这些耐药基因，在不明确的情况下使用了相关的药物，势必治疗效果较差。所以耐药基因测序检测不但是疗效考核的重要指标，更重要的是它是抗病毒药物选择的重要参考依据，避免盲目用药。基因测序法的准确度与可靠性是其他方法不可替代的，它是基因耐药检测的“金标准”。乙肝病毒耐药基因测序结果能精确指导用药，确保抗病毒治疗取得最佳疗效。