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制作者：二零零五级生物技术系冉兴鑫81050616现代，抗生素(antibiotics)作为重要临床应用药物在防治疾病和保障人类健康方面起了极其重要的作用。同时，在农业病虫害的防治方面，以其高效、低毒和易分解等优点日益受人们关注。菌种是抗生素生产的基础，因此，菌种的选育就显得尤为重要了。目前，抗生素菌种选育技术已从传统的诱变育种发展到原生质体融合技术和基因工程技术，并且以基因工程技术为主的多元化的育种方式将是今后抗生素菌种选育的主导方向。概述（目前最常用的育种技术）主要包括两个环节：1）以合适的诱变方法处理大量分散的微生物细胞悬浮液，在引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中的变异频率大大提高。常用诱变方法物理方法化学方法采用的诱变剂有紫外线（UV）、X-射线、α-射线、β-射线、γ-射线、激光和低能离子注入等。采用的诱变剂有天然碱基类似物、烷化剂、羟化剂、移码诱变剂及抗生素类诱变剂等。（化学诱变剂在诱变微生物菌种时造成的突变率通常较高、相对经济，但大多是致癌剂或极毒药品，使用时须谨慎。物理诱变法设备简单、操作方便、诱变效果好，但正变率低、筛选工作量大。）一、诱变育种（目前最常用的育种技术）2）设计一种有效的筛选方法淘汰负变菌株，并把正变菌株中少数变异幅度最大的具有优良性状菌株巧妙的挑选出来。常用筛选方法随机筛选（randomselection）推理选育（rationalselection）一、诱变育种（目前最常用的育种技术）（1）随机筛选（Randomselection）诱变育种技术中一直采用的初筛方法，它是将诱变处理后形成的各单细胞菌株，不加选择地随机进行发酵并测定其单位产量，从中选出产量最高者进一步复试。优缺点:较为可靠，不管种子或发酵过程的生产条件、生理条件如何，都与发酵罐生产条件比较接近，可以模拟进行，但随机性大，需要进行大量筛选。一、诱变育种（目前最常用的育种技术）（2）推理选育（Rationalselection）根据抗生素生物合成和代谢调控机制来指导和设计的育种方案。是诱发突变与理性化筛选方法相结合的一种育种方法。大大减少筛选的盲目性，提高筛选效率。抗自身及其结构类似物突变株的筛选抗分解代谢物阻遏突变株的筛选代谢障碍突变株的筛选抗前体及其结构类似物突变株的筛选链霉素抗性突变株的筛选形态突变株的筛选磷酸盐抗性突变株的筛选膜透性突变株的筛选金属离子抗性突变株的筛选目前推理选育最常用方法优点：一、诱变育种发展简史：起源于20世纪60年代：1960年法国Karski研究小组在2种不同类型的动物细胞混合培养中发现了自发融合现象，同时日本Okada发现艾氏腹水瘤细胞易被灭活的仙台病毒诱导融合，从而开始了细胞融合的探索。1974年Kao等在研究植物原生质体融合时发现聚乙二醇（PEG）能有效促进融合，且融合频率显著提高。PEG诱导融合的作用被证明同样适用于微生物原生质体，从而微生物原生质体融合技术迅速建立起来，在酵母、放线菌、霉菌、细菌等多种微生物的种内、种间、属间以至科间很快形成了实验体系，解除了很多技术障碍。二、原生质体融合技术发展简史：1978年国际工业微生物遗传学讨论会提出原生质体的融合问题，使这一技术迅速推广到了育种领域。1979年P首先发表了融合育种提高青霉素产量的报告，从而开创了原生质体融合技术在抗生素育种改良工作中的应用。二、原生质体融合技术包括：遗传标记的筛选原生质体的制备融合与再生融合子的鉴定融合子的筛选是原生质体融合技术的关键。二、原生质体融合技术常用的融合子筛选方法：营养缺陷型遗传标记失活原生质体供体法荧光染色标记抗药性标记另外，温度敏感型、糖发酵和同化性能、呼吸缺陷和形态等亲本标记选择方法也用于融合子的筛选，克服了营养缺陷型和抗药性标记等的缺点，而且更适合于远缘杂交。其他辅助方法如DNA含量测定、同工酶电泳电镜观察、利用毒力差异等也常和上述方法配合使用。二、原生质体融合技术目前用于抗生素菌种选育的原生质体融合技术相当成熟，已形成原生质体诱变、灭活原生质体融合、电诱导原生质体融合、原生质体再生、原生质体转化等一系列技术。利用这些技术不仅可以改善菌种的遗传性状，提高抗生素的产量和改变抗生素的组分，而且可以综合不同菌株的代谢途径，产生新的抗生素。由于原生质体融合技术具有遗传信息传递量大，能克服遗传障碍，实现远缘杂交，重组频率高等优点，为遗传育种提供了一种有效手段，所以不论是方向性还是自觉性，原生质体融合技术均比诱变育种前进了一大步，而且可以消除某一菌株在诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象。小结二、原生质体融合技术从20世纪70年代起逐步建立起来的基因工程技术，使基因或一些具有特殊功能的DNA片段的分离变得十分容易。由于链霉菌（Streptomycesgriseus）是合成天然抗生素的最重要的生物，因此基因工程育种技术在链霉菌中应用最为广泛。20世纪80年代，链霉菌遗传转化系统的建立和运用实现了链霉菌基因的克隆，1983年Hopwood等首次利用链霉菌宿主-载体系统克隆到抗生素的生物合成基因。此后链霉菌的分子生物学发展很快，已形成了以变铅青链霉菌（Streptomyceslividans）为主的外源基因克隆表达系统。简介三、基因工程技术随着分子克隆技术的发展，已形成大量有用的载体系列，对抗生素产生菌的基因表达调控研究几及抗生素生物合成的分子遗传学研究不断深入，目前已有多种抗生素的生物合成基因获得成功克隆和表达，其生物合成机理研究也已比较深入和全面。简介三、基因工程技术基因工程技术的核心是DNA重组技术，即利用供体生物的遗传物质，或人工合成的基因，经过体外或离体的限制性内切酶切割后与适当的载体在连接酶作用下连接起来形成重组DNA分子，然后再将重组DNA分子导入受体细胞或受体生物构建转基因生物，该种生物就可以按人类事先设计好的蓝图表现出新的遗传特征。三、基因工程技术在对抗生素生物合成途径及调空机制充分认识的基础上，利用DNA重组技术可在分子水平上有目的地定向改造抗生素产生菌，使之过量合成抗生素或改变原有抗生素的某些性质，合成出更适用于临床或具有新的疗效的抗生素。这主要通过以下途径实现：提高限速酶的活力，改变细胞内代谢流的方向；增加抗性基因拷贝数，提高产生菌自身耐受性；增强正调控作用或者解除负调控基因的阻遏作用；阻断支路代谢，增加有效成分；引进抗性突变；组合生物合成（combinatorialbiosynthesis）三、基因工程技术组合生物合成是近年来发现新微生物药物的研究热点，其原理是将抗生素生物合成途径中涉及到的一些酶的编码基因进行互换，由此产生一些非天然的基因组或杂合基因，从而产生许多新的非天然的天然化合物。小结与其他菌种选育技术相比，基因工程技术在很大程度上可以使人们按照预定的方向进行育种。另外，基因工程技术在一定范围内克服了传统育种的随机性和盲目性，可以打破物种间的遗传障碍，实现远源基因的重组，是最新最有前途的一种菌种选育方法。三、基因工程技术综述目前抗生素菌种选育技术发展迅速，取得了另人瞩目的成就，许多优良的生产菌种被选育出来并用于国内外的工业化生产。但还存在一些问题，如传统诱变育种的随机性大，在提高了抗生素产量的同时也伴随着有害突变的产生；原生质体融合技术只局限于2个菌之间的融合，没有扩展到3个以上的菌之间的融合；基因工程技术改良菌种有时受到限制性屏障的影响等。随着对抗生素生物合成途径及其相关基因的分子生物学研究的深入，抗生素育种技术结构将会逐步转向以基因工程技术为主的多样化的育种结构方式。基因工程育种技术的全面发展必将开创抗生素菌种选育的新局面，并为新药的筛选与开发提供一个崭新的途径。