乳酸菌菌种的分离筛选方法

1乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。一.筛选方法：1.溶钙圈法：利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养248h→挑选产生溶钙圈的菌落反复在MRS培养基上划线→挑起单菌落染色，经镜检确认为纯种→挑选革兰氏阳性单菌落→试管穿刺4℃冰箱保存。2.溴甲酚绿指示剂法：培养基：MRS培养基（含溴甲酚绿酒精溶液）筛选过程：同上，不同之处是稀释涂布后长出菌落，挑取使溴甲酚绿变色的菌落。二.菌种的分离筛选1.培养基：★1.1麦芽汁碳酸钙培养基：麦芽汁（10BX）1L预先灭菌碳酸钙5-10g/LPH自然（分离用）★★1.2牛肉膏10g/L蛋白胨10g/L酵母膏10g/L番茄汁200g/L葡萄糖10g/L吐温0.05%CaCO315-20g/L溴甲酚绿0.01%PH6.0-6.5（分离用）★1.3番茄汁碳酸钙培养基：酵母膏7.5g/L葡萄糖10g/L番茄汁100mL蛋白胨7.5g/LKH2PO42.0g/L吐温0.5mLPH6.0-6.5（分离用）1.4葡萄糖20g/L酵母膏10g/LPH6.0-6.51.5蛋白胨8-10g/L酵母膏3-5g/L葡萄糖13-15g/LKH2PO41.5-2.0g/LMgSO40.3-0.5g/LMnSO40.2-0.25g/LNaAC3.0-5.0g/LPH5.5-6.51.6蛋白胨0.8-1.0g/L糖蜜3.0-5.0g/L酵母膏3-5g/L玉米浆0.5-1.0g/LKH2PO40.1-0.3g/LMgSO40.3-0.5g/LNaC13-5g/L葡萄糖8-10g/LPH5.5-6.5（发酵或种子培养基）★★1.7MRS培养基（分离培养计数用）蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、葡萄糖20.0g、吐温801.0mL、乙酸钠5.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、琼脂18.0g、蒸馏水1L,pH6.5。（分离培养基），当MRS培养基冷却至45～50℃时,加入已灭菌的碳酸钙,充分混匀,倒平板。1.8BCP培养基（溴甲酚紫培养基）乳糖5.0g蛋白胨5.0g酵母膏3.0g0.5℅溴甲酚紫10ml自来水1000mlpH6.5-7.0（分离用）1.9BCG牛乳营养琼脂：脱脂奶粉10g，溶于50ml水中，加入1.6℅溴甲酚绿酒3精溶液0.07ml，0.075Mpa20min。另取琼脂2.0g，溶于50ml水中，加酵母膏1.0g溶解后调pH6.5-6.8，0.1Mpa20min.趁热在无菌操作下两者混合均匀，倒平板，37℃培养24h，检查是否有杂菌。2.分离筛选：2.1富集培养：取1.0g（1.0ml）于无菌细口瓶中，加入无菌麦芽汁液体培养液于瓶口处，密闭，25-32℃培养48h。若培养基表内出现绢丝波纹物，镜检杆状，革兰氏阳性，初步定为乳酸菌。以同样方法转接2-3次，接种量3-5℅.2.2菌种分离纯化：溶钙圈法：富集菌液或样品适当稀释至10-7，混菌法分离，先加入10-12mlMRS培养基或麦芽汁培养基，凝固后再注入4-5ml水琼脂培养基，制成厌氧环境，30℃或37℃培养2-3天（温度低时间稍长），可出现针头状或圆形稍扁菌落，周围形成透明圈。挑取透明圈大，培养基变黄的菌落，反复划线纯化2-3次，所得单菌落编号，经镜检后，疑似乳酸菌落接种于MRS培养基培养后保存备用。或接入液体培养基中，25-32℃培养24-48h，然后穿刺于MRS培养基或麦芽汁碳酸钙半固体培养基中，25-32℃培养48h保存备用。2.3性能测定：乳酸菌定性试验：不同条件下的产酸速率试验：将分离菌种接种于MRS液体培养基中25℃37℃温度下培养测不同菌株不同温度的pH。方法1.吸取发酵液10ml，注入空试管中，加入10℅硫酸1.0ml，在加入2.0℅高锰酸钾约1.0ml，此时乳酸转化成乙醛。取滤纸一条，在含氨的硝酸银4溶液中浸湿，横搭在试管口上，将试管徐徐加热至沸腾，使乙醛挥发，若管口滤纸变黑，证明有乳酸生成。方法2.纸层析法：展开剂为正丁醇：甲醇：水=80：15：5，毛细血管吸取发酵液，多次点样于新华滤纸上，1.5℅标准乳酸为对照，平衡2小时后进行层析，3℅溴甲酚蓝显色计算Rf值。产酸量测定：5.0ml发酵液于150ml三角瓶中，加中性蒸馏水10-20ml，酚酞指示剂2滴，用0.1mol/l氢氧化钠滴定至微红色。醋酸量（g/100mL）=氢氧化钠摩尔浓度.Vx90.08x10-3/样品毫升数x100同时，进行单因素试验，分别考察醋酸速度，耐高温，耐酒精度，耐低酸度等主要生产性能，选择优势菌株。3.菌株鉴定：3.1菌落形态：3.2菌体形态：（革兰氏染色观察）染色镜检：杆状阳性。3.3乳酸菌运动性检测：半固体穿刺法3.4生理生化：3.3.1生化试验：产过氧化氢，产硫化氢，葡萄糖产生，硝酸盐还原，产生吲哚，甲基红，明胶液化，需氧，精氨酸，糖发酵试验。3.3.2生理试验：乳酸菌产酸能力曲线：将筛选的乳酸菌接种于MRS液体培养基中，25-32℃培养48h，间隔4-6h测定发酵液pH。食盐对乳酸菌的影响：在MRS液体培养基中，添加0.0℅2.0℅4.0℅6.0℅氯化钠，菌种分别接种于培养基中，32℃培养48h，测定OD值。5溴甲酚绿指示剂法：原理：溴甲酚绿指示剂在酸性环境中呈黄色，碱性环境呈蓝色，分离培养基配制后PH为6.8，加入溴甲酚绿指示剂呈蓝绿色，产酸后菌落周围变成黄色，较容易鉴别。培养基：BCG牛乳营养琼脂初筛：将样品富集液梯度稀释，适温培养，平板上出现扁平的黄色菌落及周围培养基也为黄色初定为乳酸菌。复筛：将典型菌落转接脱脂乳发酵管，若凝固，无气泡，呈酸性，镜检细胞杆状或链球状，革兰氏染色阳性，连续传代若干次培养，挑选出3-4h能凝固的乳管保存备用。注：1.乳酸菌筛选常在几种培养基同时进行：分别在麦芽汁碳酸钙培养基，番茄汁碳酸钙培养基，BCP培养基（溴甲酚紫培养基）同时进行混菌划线或涂布培养（放厌氧袋），分别25℃37℃培养48h。菌落观察：平板表面形成浅色（黄色或白色）小菌落。麦芽汁碳酸钙培养基表面，菌落周围形成透明圈，BCP培养基（溴甲酚紫培养基）周围使紫色的培养基形成黄色包围圈。触酶反应：厌氧菌一般无触酶（过氧化氢酶），用滴管滴加3.0℅过氧化氢于菌落上，若无气泡产生，证明该菌为触酶阴性。将各种特征菌落分别接入斜面，培养后保存，进一步生理生化试验，以鉴定分别何种乳酸菌。2.菌落鉴定：半固体或双平板琼脂利于乳酸菌的生长，菌落出现早。2.1菌落形态观察：乳白色边缘不整齐，稍呈半球状凸起，实心菌落。6个体形态：半透明细杆状链状排列，大量时呈发丝状堆积。初步认为乳杆菌。2.2生化鉴定：在吲哚试验中，加入菌种试管无任何变化，为阴性反应。说明该菌不具有分解色氨酸产生吲哚的能力。明胶液化淀粉水解氢氧化钾试验均为阴性，说明此菌为乳酸菌。（过氧化氢酶还原硝酸盐）糖发酵试验：发酵果糖半乳糖葡萄糖乳糖产酸为阳性反应，其余麦芽糖蔗糖棉子糖鼠李糖产酸为阴性反应。根据手册第九版判断此种乳酸菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种。（纤维二糖甘露醇山梨醇七叶苷水杨苷）2.3乳酸菌生长曲线pH-t测定结果：78三.几种乳酸菌筛选举例1.嗜热链球菌：样品来源：市售酸奶培养基：M17改良培养基，培养温度：42℃，需氧情况：兼性厌氧，筛选方法：常规的稀释涂布和划线分离92.保加利亚乳杆菌：样品来源：市售酸奶，培养基：牛肉浸膏1.5％，酵母浸膏0.5％，葡萄糖3.0％，柠檬酸三铵0.2％，七水硫酸镁0.02％，琼脂1.5％，pH5.1。培养温度：42℃，需氧情况：兼性厌氧，筛选方法：常规的稀释涂布和划线分离法。3.双歧杆菌：样品来源：婴儿新鲜粪便，培养基：MRS培养基、NPNL培养基、TYP培养基、PTYG培养基，培养温度：37℃，需氧情况：严格厌氧，筛选方法：常规的稀释涂布和划线分离法。