单细胞凝胶电泳试验

1单细胞凝胶电泳试验（一）原理单细胞凝胶电泳试验（singlecellgelelectrophoresis，SCGE）是近年来经过不断完善逐步发展起来的一种快速检测单细胞水平DNA损伤的新技术。有核细胞的DNA分子量很大，DNA超螺旋结构附着在核基质中，SCGE分析技术是先用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上，在细胞裂解液的作用下，细胞膜、核膜及其它生物膜遭到破坏，使细胞内的RNA、蛋白质及其它成分外泄到凝胶中，随后扩散到细胞裂解液中，但核DNA仍保持缠绕的环区附着在剩余的核骨架上，并留在原位。如果细胞未受损伤，电泳时，核DNA因其分子量大停留在核基质中，荧光染色后呈现圆形的荧光团，无拖尾现象。若细胞受损，在中性电泳液（pH=8.0）中，核DNA仍保持双螺旋结构，虽偶有单链断裂，但并不影响DNA双螺旋大分子的连续性。只有当DNA双链断裂时，其断片进入凝胶中，电泳时断片向阳极迁移，形成荧光拖尾现象，形似彗星。如果在碱性电泳液（pH13）中，先是DNA双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂的碎片分子量小可进入凝胶中，电泳时断链或碎片离开核DNA向阳性迁移，形成拖尾。细胞DNA受损愈重，产生的断链或碱易变性断片就愈多，其断链或断片也就愈小，在电场作用下迁移的DNA量也就越多，迁移的距离越长，表现为尾长的增加和尾部荧光强度的增强。因此，通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度可定量地测定单个细胞的DNA损伤程度。（二）仪器1．全磨砂载玻片2．1号盖玻片3．微量吸管和吸头4．冰盒5．电泳仪6．荧光显微镜（三）试剂1．正常熔点及低熔点琼脂糖。2．细胞裂解液：2.5mol/LNaCl，100mmol/LNa2EDTA，10mmol/LTris-HCl，1％肌氨酸钠，用NaOH调pH值到10。用前加1％TritonX-100和10％DMSO。23．碱性电泳液：1mmol/LNa2EDTA，300mmol/LNaOH调pH到13。4．0.4mol/LTris-HCl缓冲液（pH=7.5）。5．荧光染料：2.5µg/ml的溴乙锭，也可用8.5µg/ml的吖啶橙或2.5µg/ml的碘丙锭等。（四）方法1.制备细胞悬液单细胞来自人、动物(小鼠、大鼠、狗、鱼、鸡等)和植物的组织或培养的细胞系，或从活体组织分离出的原代细胞等。动物体内测试可以根据靶器官适当选择有针对性的原代细胞进行测试。选择合适的培养基和缓冲液，分离纯化制成单细胞悬液，用台盼蓝法测定细胞存活率95%，细胞密度为(1～5)×105/mL备用。2.凝胶制片为了加强凝胶对玻片的附着力，在载玻片上先铺一基底层：在磨砂面上滴加45℃水浴后的0.5％～1.0％正常熔点琼脂糖50µl。然后再铺胶2层。第1层：取密度为3×105/ml的细胞悬液，以体积比为1：9的比例与预热到37℃的0.5％低熔点琼脂糖混匀，取50µl加到第1层胶上，铺匀凝固；第2层：以0.5％低熔点琼脂糖覆盖中层细胞，这样制成细胞“三明治”。3.细胞裂解将细胞“三明治”载玻片浸入新配制的预冷4℃的裂解液中，保持4℃1-2h。4.DNA解旋细胞裂解后，将载玻片置于水平电泳槽内，用新配制的碱性电泳液盖过胶面约2～3mm，加盖避光，置于4℃20～40min。使DNA充分解旋。碱性条件下（pH13）可使DNA展开、解旋为单链，碱性易变性区段(ALS)变为单链断片(SSB)。5.电泳DNA解旋结束后，通电电泳。电泳条件为25V和300mA，电泳10～30min。或按0.7～0.9V/cm确定电压。最适条件实验者可自行选择。最好能使阴性对照有部分细胞出现短拖尾，以保证试验有足够的敏感性并减少实验室间差异。6.中和与染色电泳后取出载玻片，在0.4mol/LTris-HCl缓冲液（pH=7.5）中浸没15min或漂洗3次，每次5min。每张胶板上滴加20～100µl荧光染色剂，后用蒸馏水洗涤。以上各步骤应在黄或红光下操作。中和后的凝胶片应在24h内染色，以免DNA过多3扩散。否则应将之浸入无水乙醇或无水甲醇中脱水5min左右，或在室温中晾干。对于干燥的凝胶片，使用中性缓冲的甲醛处理数分钟，将有利于长期保存。7.结果观察结果观察有肉眼观察测量和图像分析两种方式。在荧光显微镜下，观察单细胞电泳图像(放大200～400倍)，每片记数25～50个细胞，每个剂量组检查100个细胞。无DNA损伤的细胞表现为一圆形荧光细胞核。DNA受损的细胞所产生的DNA断片游动移出细胞核之外，向阳极伸延而形成“慧头”带“慧尾”的慧星现象。镜下观察时，首先应记录出现拖尾的细胞数，计算拖尾细胞率。同时用目镜测量拖尾细胞的尾长，统计各试验（剂量）组的平均尾长。尾长是指DNA断片从其主核向电泳正极迁移的距离，而不同的实验室尾长测定方法有所不同。但并不妨碍将各剂量组平均尾长与阴性对照组进行比较。图象分析需有相应的设备和专门的分析软件。使用电脑逐个对细胞进行图像分析。应用图像分析系统可得到更多的分析参数。目前主要观察指标有尾长（taillength）、慧尾DNA的百分含量、尾距（tailmoment）、尾块(taillocal)和尾惯量（tailinertia）等。尾长(taillength)即DNA迁移的长度，在低损伤剂量范围内与DNA损伤呈线性关系；尾矩是尾长与慧尾DNA百分含量之乘积，在高损伤剂量下与损伤程度呈线性关系；尾块(taillocal)即彗星尾部分散的大小不一的DNA断片组成，与损伤程度有关；尾惯量是与每个尾块的面积、平均荧光强度、在X轴上与彗核中心距离有关的综合性指标。目前通常选用DNA迁移细胞率、尾长、尾矩作为检测指标。目前，国外彗星电脑分析软件主要有英国KineticImaging公司的KOMET、美国LAI公司的LAICometAnalysisSystem(LACAS)、德国Zeiss公司的KS400分析系统、捷克LIM公司的Lucia彗星图像分析系统等，这些软件能定量测定尾部长度、尾部面积、尾部力矩、尾部力矩臂、尾部力矩惯性、细胞密集程度、尾部的DNA百分比、碎片等。但这些软件均需与其相应的仪器设备配套使用，价格十分昂贵。国内也正在开发一些分析系统。除了昂贵的商业软件外，也有一些免费的彗星分析软件。如Helma等所设计的分析软件(SicionImage)能测量彗星强度、尾长、头面积、尾面积、尾部DNA含量、尾矩等多项参数。Konca等在Helma的基础上研制了另一软件(CASP)，4该软件可在多种硬件及软件平台上运行，所测量的彗星参数中增加了Olive尾矩，而且用户界面更友好。这2个免费软件的一个特点是，它们的源代码是公开的，人们可以看到每一个彗星参数的运算方法和编写程序。因此，软件使用者可以根据实验目的的不同来改变这些参数的运算方法和计算程序，从而建立一个新的测量遗传损伤的参数。这些源代码文件很简单，可以自行改写，以便使之适用于分析要求，如计算Ames试验菌落数以及电泳凝胶的分析等。Helma2000年建立了免费下载系统，其网址为：和。近年来使用较多的国外免费分析软件见以下网址：；。随着彗星试验的发展，在资源共享的网络空间里，会有更完善更方便的彗星分析软件出现。（五）注意事项虽然SCGE具有简便、快速等特点，但在整个实验过程中可能会受到诸多因素的影响而难以得到理想的实验结果。下面是几点注意事项。1.单细胞悬浮液的制备：最好将细胞数目调至约3.0×105个/ml。如果细胞数目过高，位于凝胶不同层面的细胞可能会发生相互重叠，难以对其结果进行分析；如果细胞数目过低，则很难对实验结果进行统计学分析。2.制片：目前制片的方法主要有三种:“三明治”凝胶、双层凝胶和单层凝胶。制片总的原则是:获得牢固稳定凝胶的同时，避免额外DNA的损伤与修复。3.电泳条件：SCGE一般选用低电压和短时间。电压过高、电泳时间过长虽然能够提高检测的灵敏度，但也会使正常的细胞形成拖尾而出现假阳性结果；反之，电压过低、电泳时间过短，受损细胞不会形成拖尾而出现假阴性结果。4.实验条件：整个实验过程需在低温(约4℃)和暗光下进行，避免额外DNA的损伤和修复，防止假阳性和假阴性结果的产生。5.与凋亡细胞DNA断片的区分：由于试验剂量过大或细胞保存不当及某些不适的试验条件的影响，会出现细胞坏死和凋亡，坏死和凋亡细胞会产生大量DNA断片，也会在电泳以后出现拖尾。由于它们与常见DNA断裂剂诱导的DNA损伤在形成机制、生物学和毒理学上的意义迥然不同，应对它们进行区分，排除对实验结果的干扰。在碱性彗星试验中，凋亡细胞与普通DNA链断裂损伤细胞的差异主5要是：①在彗星形态上，凋亡细胞的DNA断片彗星头很小，头长不超过5µm，仅由核内不能裂解的与蛋白质框架相连的DNA片段组成，亮度高，慧尾近似椭圆形，纵径与横径的比值小，彗星头与慧尾之间往往有一分离带。而普通DNA链断裂，彗星头直径一般都大于10µm，尾纵径明显大于横径，同时彗星头与慧尾之间没有明显界限，因为一部分慧尾是由单个链断端的延伸形成，它的另一端仍与主核相连。②无论在低剂量组还是在高剂量组，凋亡细胞的DNA断片形态基本一致，尾长也基本相同，其剂量-反应关系表现为凋亡指数增加，而不是尾长增加。而DNA链断裂损伤的剂量-反应关系表现为彗星尾长的增加。（沈孝兵，浦跃朴）