大肠杆菌感受态细胞的制备与转化

实验七大肠杆菌感受态细胞的制备与转化1、学习掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法2、学习和掌握热激法转化大肠杆菌的原理和方法3、把实验六连接反应产物进行转化实验实验目的1）相关名词概念将质粒导入大肠杆菌或其它细胞内的过程叫作转化。与噬菌体不同，质粒本身不具备感染细胞的能力。为了使细胞能吸收外来DNA，必须改变其细胞生理状态，使之具有很高的接收外源DNA的能力，这种具有接收外源DNA能力的细胞叫感受态细胞。2）CaCl2-热激法转化原理CaCl2能改变细胞膜的通透性，大肠杆菌经低渗CaCl2溶液致敏处理，就变成高效的感受态细胞；感受态细胞与质粒混匀于0℃时，混合物中的DNA形成抗DNase羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，再经42℃短时热激时进入细胞内实现转化，利用质粒上的遗传选择标记在LB平板上进行初步筛选转化菌落。实验原理1、材料菌株：E.coliTOP10质粒：pBI121-chs(实验六连接反应产物)2、试剂LB液体培养基、LB/Amp(100ug/mL)固体培养皿、灭菌0.1mol/LCaCl2、灭菌去离子水试剂与器材实验步骤•（一）CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞•1）挑取纯化的大肠杆菌TOP10单菌落接种于盛有5mLLB液体培养基的小三角瓶里，37℃，180rpm振荡培养过夜；•2）取1mL培养菌液接入100mL液体培养基中，37℃180rpm振荡培养至OD600为0.5-0.6，冰浴15min；•3）将菌液分别移入1.5mL无菌EP管中，4℃，4000rpm离心5min，弃上清，沉淀用1mL预冷的0.1MCaCl2（过滤灭菌）悬浮，用枪头轻轻混匀，冰浴15min；•4）4℃，4000rpm离心10min，弃上清，沉淀再加200μL预冷的0.1MCaCl2，轻轻重悬，冰上放置0.5~5小时后，即可用于转化；或每管加灭菌甘油至终浓度15%，混匀，液氮冷激后置于-70℃冰箱保存。•（二）热激法转化E.coliTOP101）将连接产物10μL转移至装有200μL感受态细胞的1.5mL离心管中，轻轻混匀（并设置1管负对照：200μL感受态细胞悬液+10μL无菌双蒸水）；2）冰浴30min后，42℃热激90sec,冰浴2min；3）加入800μL无抗生素的LB液体培养基，在37℃小于180rpm下振荡培养0.5~1小时；4）复苏后的菌液在4000rpm下常温离心3min，吸取上清液900μL留约100μL菌液在离心管底部，并用移液枪轻轻吹打重悬；5）用移液枪将重悬菌液移入带有相应抗生素（Amp:100μg/mL,平板表面涂有20mg/mL的X-gal40μL和20mg/mL的IPTG40μL）的37℃保温的LB固体培养基平板上，用灭菌的涂布器涂布均匀；6）将平板倒置于37℃恒温箱中培养12～18小时。实验预期结果作业1、详细描述你的实验结果，并分析实验中应注意的细节2、可将外源基因转化受体细胞的方法有哪些？