生物信息学分析

4、生物信息学分析通过核苷酸序列数据库和基因序列同源性在线分析途径初步对Rv2029c基因进行分类整理。由于结核分枝杆菌耐利福平野生株与核苷酸序列数据库KEGGGENES中的结核分枝杆菌标准株H37Rv的匹配率为100%，以下对基因的分析按照结核分枝杆菌标准株H37Rv的数据库信息进行，即完全匹配的1020bp长度序列（本次提取基因中包含上下游引物等序列，较长，1346bp）。4.1基本信息表1基因基本信息条目Rv2029c基因名称PfkB定义6-磷酸果糖激酶PfkB组织来源结核分枝杆菌耐利福平野生株功能参与醣酵解：将糖-1-P转化为糖-1,6-P功能类别参与中间代谢与呼吸作用4.2基因组信息表2基因组信息基因组结核分枝杆菌H37Rv（标准株）基因长1020bp氨基酸339分子量35401.4Da等电点5.6648蛋白结构域(图3)1、FruK（果糖-1-磷酸激酶(FruK)和关联的果糖-6磷酸激酶（PfkB）），位点13-3142、1-PFK（己糖激酶，1-磷酸果糖激酶家族），位点14-3123、PRK10294（6-磷酸果糖激酶2），位点12-3134、PfkB（PfkB家族碳水化合物激酶）,位点18-3085、PLN02341（PfkB型碳水化合物激酶家族蛋白），位点208-2946、PTZ0029（核糖激酶），位点205-301药物靶点1、同源基因没有药物靶点2、非同源但序列相似基因没有药物靶点图3蛋白结构域4.3蛋白表达4.3.1二级结构分析预测结果显示，PfkB蛋白的二级结构中β转角占46.61%，α螺旋占33.63%，β折叠占19.76%。转角结构和螺旋结构构成了结核分枝杆菌PfkB蛋白二级结构的骨架。图4蛋白二级结构4.3.2跨膜区分析Tuberculist跨膜蛋白预测结果表明：蛋白长度339aa，预测跨膜蛋白数0。图5蛋白跨膜区分析4.3.3信号肽预测PredictProtein分析表明PfkB蛋白氨基酸残基没有信号肽，由此推断此蛋白不包含信号肽，不是分泌型蛋白质。图6蛋白信号肽预测4.3.4疏水性分析分析结果显示，蛋白最大疏水指数为2.411，最小疏水指数为-2.372。图7蛋白疏水性分析4.3.5DNA同源性分析表3基因同源性分析菌株序列覆盖率E值一致性MycobacteriumtuberculosisstrainBeijing-like,completegenome100%0.0100%Mycobacteriumbovissubsp.bovisAF2122/97completegenome100%0.0100%Mycobacteriumtuberculosis18bgenome100%0.0100%MycobacteriumtuberculosisH37RvSiena,completegenome100%0.0100%Mycobacteriumtuberculosisstr.KuronoDNA,completegenome100%0.0100%Mycobacteriumtuberculosis49-02complete100%0.0100%菌株序列覆盖率E值一致性genomeMycobacteriumtuberculosisH37Rv100%0.0100%MycobacteriumbovisstrainATCCBAA-935,completegenome100%0.0100%Mycobacteriumtuberculosisstrain96121,completegenome100%0.0100%Mycobacteriumtuberculosisstrain96075,completegenome100%0.0100%4.3.6与4株卡介苗（BCG）标准株DNA对比表4基因与BCG标准株DNA对比菌株E值一致性MycobacteriumbovisBCGPasteur1173P20.099%MycobacteriumbovisBCGstr.Tokyo1720.099%MycobacteriumbovisBCGstr.Korea1168P0.099%MycobacteriumbovisBCGstr.Mexico0.099%4.3.7蛋白质同源性分析NCBI蛋白质Blast结果如下表5蛋白同源性分析蛋白基因序列覆盖率E值一致性phosphofructokinase[Mycobacteriumtuberculosiscomplex]100%0.099%蛋白基因序列覆盖率E值一致性phosphofructokinase[Mycobacteriumtuberculosis]100%0.099%phosphofructokinasePfkB(phosphohexokinase)[Mycobacteriumorygis]100%0.099%phosphofructokinase[Mycobacteriumtuberculosis]100%0.099%phosphofructokinase[Mycobacteriumcanettii]100%0.099%phosphofructokinase[Mycobacteriumtuberculosis]100%0.099%讨论结核分枝杆菌的潜伏感染使结核病的控制与预防变得更加困难，是结核在人群中传染的重要途径。由于结核菌潜伏感染期的调节机制仍不明确，导致全世界政府至今仍未彻底控制结核病的传播。目前研究较多的是针对与细菌休眠期密切相关的调节子展开，以期通过研究其调节的潜伏性抗原而在结核病潜伏期的诊断与治疗上作出突破。Rv2029c基因是DosR中的一个潜伏感染基因，其参与结核菌的中间代谢与呼吸作用。本实验通过提取结核菌基因组、PCR扩增等步骤，所得测序基因与目的基因100%匹配，即从结核分枝杆菌耐利福平野生株提取的Rv2029c基因与GenBank收录的结核分枝杆菌标准株H37Rv的Rv2029c基因一致，未发生突变。DNA同源性分析基因得知结核分枝杆菌标准株H37Rv与其他杆菌之间、与4株卡介苗（BCG）标准株之间DNA对比完全匹配，即其他杆菌与标准株同样具有完整Rv2029c基因。蛋白质同源性分析中，Rv2029c所编码蛋白在多株结核杆菌中表达。蛋白质疏水性与蛋白功能密切相关，并且在蛋白质结构、构象及与其他蛋白质间相互作用等方面也起着重要作用，蛋白质疏水性信息有时也常被用于跨膜螺旋的预测。膜蛋白跨膜结构预测对研究蛋白质功能有着十分重要的作用，因此膜蛋白跨膜结构预测也是目前生物信息学研究中较为热门的课题。蛋白二级结构以α-螺旋、β-折叠和转角为主，构成蛋白质的二级结构。通常，数量较多的α-螺旋结构利于蛋白质结构的稳定而β转角对蛋白质的功能起决定性影响。蛋白二级结构分析对于开展蛋白免疫功能研究具有一定的指导意义。结论结核分枝杆菌Rv2029c基因是一个结核潜伏感染相关基因，基因长度为1020bp。所编码蛋白为6-磷酸果糖激酶，参与细菌中间代谢和呼吸作用。该蛋白由339个氨基酸组成，分子量为35401.4Da，等电点5.6648；不包含信号肽，不是分泌型蛋白质；二级结构中β转角占46.61%，α螺旋占33.63%，β折叠占19.76%；预测跨膜蛋白数0个，最大疏水指数为2.411，最小疏水指数为-2.372。Rv2029c基因所转录蛋白与细菌代谢密切相关，且在人型结核分枝杆菌标准株和BCG标准株间无差异，理论上可以通过检测其存在情况来检测病人是否存在潜伏感染。本实验为以后建立基于DosR的结核病早期及潜伏感染诊断方法奠定基础。而最终结果仍有待日后大量实验验证。