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液相色谱的方法开发（二）梯度方法梯度洗脱的特点优点单位时间的分离能力增加检测灵敏度提高缺点仪器设备要求高不适合某些检测方式柱需再生定量分析的重复性较低梯度的洗脱方式高压梯度及低压梯度溶剂A溶剂B泵A泵B混合器A高压梯度溶剂A泵溶剂B比例阀（溶剂混合点）混合器B低压梯度（溶剂混合点）梯度洗脱的可变参数A及B液的成分和化学特性梯度的陡度梯度的变化形状1243567891011如不用梯度：分离不理想梯度条件的优化梯度曲线压力曲线梯度曲线的变化∶凹线梯度曲线的变化∶凸线梯度平衡时间的影响（一）10分钟的梯度，6分钟的平衡时间色谱图不重复梯度平衡时间的影响（二）平衡时间∶6分钟平衡时间∶7分钟平衡时间∶8分钟平衡时间∶9分钟平衡时间从6到7分钟，第一个峰的保留时间有明显的变化，说明6到7分钟的平衡时间不足，而8到9分钟变化不大因而大于这个时间时，平衡充足。有机污染物的影响（一）50ml超纯水的有机物污染状态有机污染物的影响（二）“三蒸水”有大量的有机污染物不适合梯度分析有机污染物的影响（三）典型的“实验室水”有大量的有机污染物不适合高灵敏度梯度分析梯度方法开发实例-第一步开发一个有9个烷基苯酮化合物的梯度方法，用C18柱，在最初的条件下(0-100%水-乙腈)，分离不理想。整个色谱峰组保留时间太长，分离度也不好。梯度方法开发实例-第二步为使色谱峰前移，提高起始时乙腈的比例（50-100%，水-乙腈），分离得到改善。但是9个化合物出了10个色谱峰，说明有杂质存在，很可能是流动相水中的。梯度方法开发实例-第三步从空白梯度图显示，在同样的色谱条件，同样的检测灵敏度下，共有两个杂质峰。说明流动相水中的杂质在此条件下可能会对检测有影响。梯度方法开发实例-第四步空白梯度图同样品的色谱图进行对照后，我们看到杂质（共两个峰）中的第一个小峰对第8个色谱峰有干扰，会使其定量分析结果不准确。梯度方法开发实例-第五步根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，试用#5曲线使3-9号峰提前(曲线5，50-100%B)，但是小峰仍没有分出来。梯度方法开发实例-第六步根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，试用#5曲线使3-9号峰提前，改用50-95%B见到好的现象。梯度方法开发实例-第七步最后用50-90%B，曲线4，得到好的结果。