反相层析

第八章反相层析ReversedPhaseChromatographyRPC•原理•介质•技术•应用概述•反相层析法的建立追述到1950年，Howard和Martin用正辛烷作为固定相，水作为流动相进行石蜡油的液-液层析分离，并且把这种方法命名为反相层析；•所谓“正相”或“反相”，主要是指固定相和流动相的相对极性大小，反相层析因与传统分配层析刚好相反而得名，其固定相非极性强而流动相极性相对较高，样品中组分被洗脱的顺序是极性较高的组分先流出，极性较低的后被洗脱。反相层析可分离的溶质范围很宽，从极性较大的寡肽、小分子有机物到疏水性较强的生物大分子。反相层析的广泛应用也得益于流动相的特殊溶剂效应和大范围的溶剂强度变化，从极性很大的纯水流动相到非极性溶剂，其溶剂洗脱强度的变化使溶质保留值的差别可以达到1-2个数量级。反相层析能够区分分子在疏水性质方面的细微差异，而有效地进行分离，具备高分辨特性。一、原理•基于溶质分子与固定相中键合在基质上的疏水性配基间的疏水相互作用•反相层析机理普遍被人们接受的是由Horvath于1976年提出的疏溶剂理论（solvophobictheory）:疏溶剂理论假设反相层析介质是表面均匀密集的覆盖着非极性配基的颗粒，溶质分子由于受到极性流动相的斥力而以其疏水部分结合至固定相的非极性配基上，除此之外溶质与固定相之间不存在其他任何相互作用。硅胶类介质往往存在“亲硅醇基效应”（silanophilicinteraction）•一定条件下，硅胶表面残余的硅醇基能与溶质发生相互作用而对溶质的保留行为起决定作用;•亲硅醇基效应常导致溶质保留值重复性较差，洗脱峰脱尾等不良层析行为;•硅胶表面均匀覆盖非极性配基，对残余硅醇基屏蔽，可基本排除亲硅醇基效应的影响。新型反相层析介质聚苯乙烯等高分子聚合材料的开发，可根本消除亲硅醇基效应的影响。流动相组成•影响层析过程的容量因子和选择性，从而对分辨率产生影响•一般由水、有机溶剂、酸、离子对试剂（ionpairingagent）等组成：有机溶剂又称为修饰剂（modifier），其作用是降低流动相极性；酸的加入是调节pH至酸性范围内，有助于抑制离子化作用，包括抑制溶质的酸性基团和硅胶介质的硅醇基发生解离；离子对试剂是通过离子作用与溶质分子结合，引起溶质疏水性质的改变从而调节溶质的保留行为。•反相层析对所用有机溶剂的要求是能够与水互溶，有较低的紫外截止波长和较低的黏度，常用有机溶剂的性质见表9.3•反相层析的流动相大多采用二元系统，即由水和一种有机溶剂组成，但据分离实际需要，也可采用两种甚至两种以上的溶剂构成三元、四元的流动相系统，以期获得合适的洗脱强度和最佳的选择性。层析过程中pH的控制至关重要•因为流动相pH的改变影响到溶质的解离状态、固定相表面残留硅醇基和其他吸附基团的解离情况、以及添加至流动相的可解离组分的离子平衡（a）pH2和（b）pH12分离血管紧张肽Ⅱ和血管紧张肽Ⅲ（样品：血管紧张肽Ⅱ，0.25mg/mL，血管紧张肽Ⅲ，0.25mg/mL；层析柱：RESOURCERPC3mL，6.4×100mm；流动相A：（a）0.1%TFA，pH2，（b）10mmol/LNaOH，pH12；流动相B：（a）0.1%TFA，60%乙腈－水溶液，（b）10mmol/LNaOH，60%乙腈－水溶液；梯度：10min内10－65%B；流速：2mL/min。）•离子对试剂中很多本身就是酸或碱（p271)，可同时起维持流动相pH的作用。离子对试剂典型的使用浓度范围是0.01%~0.1%或10~100mmol/L•离子对试剂要求在高浓度的有机溶剂中有足够的溶解度，用UV检测，离子对试剂对波长在220nm以上的紫外线不能有明显的吸收，如使用带有芳香环的离子对试剂，则须用荧光、视差折光等检测方法二、层析介质•由多孔基质颗粒键合疏水性的配基组成，因具较小的颗粒直径，普遍有较高的柱效；•反相层析领域使用时间最长，应用最广泛的基质是硅胶缺点：高pH下非常不稳定新开发以合成有机物作为基质的反相介质-如聚苯乙烯-二乙烯苯类，具优良的化学稳定性，强酸强碱下的稳定性弥补了硅胶基质的缺陷。•反相介质的选择性主要由键合在基质上的配基类型决定。最常用的配基是线性的正烷烃基团（n-烷基），如n-辛基（C-8）、n-十八烷基（C-18），此外也会采用n-丙基、n-丁基、n-丙基苯基、二苯基等疏水基团。•几种常见的反相介质（一）SOURCETMRPC（聚苯乙烯颗粒）能耐受反相层析中常用的有机溶剂，对6mol/L的盐酸胍、0.1%的SDS等具良好耐受能力各种肽、蛋白质、寡聚核苷酸等分析和制备型分离纯化（二）μRPCC2/C18（多孔硅胶微粒为基质）在有机溶剂中稳定性较好，但pH稳定范围较窄，仅能在pH2～8范围内使用，对变性剂、去污剂等试剂具良好的耐受，操作温度范围4～40℃粒径小，适合肽谱分析和极微量纯化过程（三）SephasilProtein/SephasilPeptide（多孔硅胶为基质）理化稳定性和μRPCC2/C18介质相似，温度范围4～70℃三、技术•反相介质的选择和层析柱的准备•流动相的选择和准备•样品的准备和加样操作•洗脱模式的选择和条件控制•样品的检测和收集•层析柱的再生、清洗和贮存㈠介质的选择考虑样品组分的种类和性质、分离的规模及对分辨率的要求、流动相条件：•待分离物分子量，对介质孔径的选择提供指导；•样品组分的疏水性质决定采用何种配基；•分离的规模及对分辨率的要求也是须考虑的因素，通常分离规模和分辨率的关系是负相关的；•反相层析时的流动相条件很大程度上影响反相介质基质的选择。㈡反相层析柱的尺寸和预装柱的选择•层析柱的尺寸由内径和柱长所界定，其取值主要取决于分离的规模和所需的分辨率，其中内径的取值与分离规模相关，而柱长和分辨率之间则存在一定的联系；•反相层析介质都属于高效层析介质，粒径很小，对填充技术的要求很高，人们可据所选择的介质种类和层析柱尺寸直接选择对映的反相层析预装柱，预装柱平衡后可直接使用；•层析柱的平衡，一般用流动相A对层析柱进行充分的平衡。㈢流动相的选择和准备•乙腈和甲醇是最常用的，条件摸索阶段以其中一种作为修饰剂，溶质在固定相上吸附较为牢固时，可考虑更换洗脱能力较强的修饰剂如异丙醇等；•溶质分子，特别是蛋白质等生物大分子在所用溶剂中的稳定性是须考虑的因素；•分离样品性质不明的情况下，一般流动相A为水相，不含修饰剂，而流动相B为100%有机相；•反相层析多数在低pH条件下运行，流动相的pH通过添加一定浓度的酸来调节；•往流动相中添加离子对试剂可以改变溶质的保留值和选择性，获得较好的分离效果；•对于带正电荷的溶质应选择带负电荷的离子对试剂，如三氟乙酸等，对于带负电荷的溶质则应选用带正电荷的离子对试剂，如季铵盐等。㈣样品的准备和加样操作•理想情况下应将样品溶于流动相A后加样，如样品在流动相A中溶解不好，可考虑添加有机酸、盐类等试剂来增加样品的溶解性；•样品在加样前应当通过10000g离心10min或用0.22μm微孔滤膜过滤除去任何可能存在的颗粒物；•反相层析柱通常是预装柱或带有可调接头的自装柱，连接于HPLC系统，加样操作按HPLC系统提供的标准进行。㈤洗脱模式的选择和条件控制•在洗脱模式方面，反相层析和离子交换等层析技术具相似性，分为阶段洗脱和梯度洗脱；•梯度洗脱是采用修饰剂体积分数连续变化的流动相对吸附样品进行洗脱。梯度的形状主要分为线性梯度和非线性梯度，其中线性梯度又可分为连续线性梯度和分段线性梯度。连续线性梯度和分段线性梯度的比较在流速恒定的情况下梯度斜率改变对分辨率的影响（样品为一段合成肽，层析柱为SephasilPeptideC185μmST4.6/100，流动相A为0.06%TFA水溶液，流动相B为0.055%TFA-84%乙腈，流速为1ml/min，梯度：（A）0～60%，（B）20～35%。）•流动相中有机溶剂种类、酸的使用和pH值、离子对试剂种类等都会对选择性和分辨率产生影响；•分离一些低分子量物质时，升高柱温（降低流动相的黏度，增加传质速度，减少区带变宽现象）也是一种较为常用的改善分辨率的方法；•降低流速一定程度上可提高柱效，但同时也会增加溶质的纵向扩散，过低的流速反而会造成分辨率下降，同时使分离时间延长。样品的检测和收集•和其他层析技术一样，反相层析中最常用的也是紫外检测（很多情况下，有机溶剂或添加剂等的存在总会对样品的检测产生一定的影响）•对于能产生荧光的物质，使用荧光监测器往往比紫外检测有更高的选择性和灵敏度。•此外，视差折光检测器、电导检测器等也都能用于层析样品的在线检测。层析柱的再生、清洗和贮存•再生常用2～5个柱体积的流动相B流经层析柱移去残留在层析柱上的物质；•清洗常运行线性梯度从0.1%TFA到0.1%TFA异丙醇，再几个柱体积的0.1%TFA异丙醇溶液，最后运行线性梯度从0.1%TFA异丙醇溶液重新回到0.1%TFA水溶液；•基于硅胶的介质常保存在纯的甲醇中，基于聚苯乙烯的介质常保存在甲醇或20%乙醇中四、应用•脱盐•分析型分离•制备型分离㈠脱盐特点：属吸附技术，容许待脱盐样品的体积很大，洗脱后的样品在很小的体积范围内被洗脱，完成脱盐的同时实现样品的浓缩反相层析脱盐后，蒸发除去流动相，所得样品重新溶解在所需缓冲体系中后可以进行下一步操作。（A）凝胶过滤层析，（B）反相层析用反相层析脱盐时，盐类等小分子不发生吸附，从V0开始被洗脱，至Vc处基本洗脱完毕，而生物大分子在换用有机溶剂后被洗脱UltraporeRPSC反相层析柱上从E.coli纯化核糖体50S大亚基蛋白质㈡核糖体蛋白质的分离纯化㈢微量蛋白质的鉴定（A）胶质细胞蛋白质SDS-PAGE一条区带胶内降解后提取的肽段的反相层析曲线;（B）A图框内区域的放大在不同规模上制备型纯化rhEGF（A）层析柱尺寸6.4×100mm，加样量2.14mL，（B）层析柱尺寸35×100mm，加样量62.5mL㈣制备型分离纯化