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第七章层析分离技术（7）本章内容7.1层析技术导论7.2凝胶过滤层析7.3离子交换层析7.4亲和层析7.5固定金属离子亲和层析7.6疏水作用层析7.7反相层析7.7反相层析一、基本原理二、反相介质的种类三、特点及用途四、影响因素五、高效液相色谱简介7.7反相层析一、基本原理反相层析（Reversed-phasechromatography,RPC）利用非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，是根据溶质极性（疏水性）的差异进行分离纯化的层析技术。反相层析属于分配层析，溶质在固定相（非极性介质）和流动相之间的分配系数取决于溶质的疏水性：溶质的疏水性越大，其在固定相中的分配系数越大。烃类化合物的分配系数与其分子所含碳原子数成正比。当固定相一定时，可通过调节流动相的组成来调整溶质的分配系数。流动相的极性越大，溶质的分配系数越大。因此，RPC多采用降低流动相极性（水含量）的线性梯度洗脱法。7.7反相层析二、反相介质的种类反相介质的商品种类繁多，其中最具代表性的是以硅胶为载体，通过硅烷化反应在硅胶表面键和非极性分子层。硅烷化反应式如下：其中，硅烷化试剂中R1和R2多为甲基，R为C4、C8、C18烷基或苯基，一般简称为C4、C8、C18柱等另外，高分子聚合物也可作为反相介质，如：聚丙烯酸酯-C187.7反相层析三、特点及用途一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。为了得到更好的分离效果，有时加入一定浓度的三氟乙酸（TFA）适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC主要用于相对分子质量低于5000，特别是1000以下的非极性小分子物质的分析和纯化，也可用于蛋白质等生物大分子的分析与纯化。由于反相介质表面为强烈疏水性，并且流动相为低极性的有机溶剂，生物大分子在RPC过程中容易变性失活。因此，以回收生物活性蛋白为目的时，应注意选择适宜的反相介质和流动相。随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。7.7反相层析三、特点及用途相似之处：均是利用不同物质与固定相之间的疏水性作用力不同进行色谱分离。不同之处：①固定相的疏水程度不同；②流动相组成不同；③操作方式不同；④应用范围不同。反相色谱与疏水作用色谱的比较7.7反相层析四、反相层析的影响因素•在反相介质已经确定的情况下，影响反相层析分辨率的因素主要包括：流动相的组成、洗脱模式、层析柱尺寸、流速、温度等。•1.流动相•2.洗脱模式•3.层析柱的尺寸•4.流速•5.温度1.流动相1)流动相的组成：流动相中的有机溶剂可降低流动相的极性，流动相极性越低，其洗脱能力越强，因此洗脱时通常采用的有机溶剂比例会逐渐提高，以使各样品组分按疏水性由弱到强的顺序洗脱；对有机溶剂的要求：与水互溶、由较低的紫外吸收及较低黏度（如乙腈、甲醇、乙醇等）。2）流动相的pH值：反相层析的流动相条件多在低pH值下（pH2-4）层析介质（如硅胶）在高pH下不稳定；很多组分在低pH下具有较好的溶解性；低pH抑制了样品组分中酸性基团及硅胶上硅醇基的解离；为了使流动相保持在低pH下，在流动相中加入酸（如三氟乙酸（TFA））。2.洗脱模式由于溶质中不同组分的疏水性强弱不同，与固定相结合的牢固程度不同，在起始条件下，极性很强的组分不能结合在固定相上面直接被洗脱，其余组分结合在固定相表面，为了将这些组分洗脱下来，必须降低流动相的极性，即增加流动相中有机溶剂的比例。因此，反相层析的洗脱过程中流动相的组成随时间而变化。通常可采用阶段洗脱和梯度洗脱。最理想的洗脱条件是通过多次实验优化后得到的。3.层析柱的尺寸层析柱的尺寸由其内径和柱长所决定，内径影响层析的规模，但对分辨率没有影响，柱长对分辨率的影响则与溶质的种类有关。对于小分子有机物，增加柱长可以提高柱效改善分辨率，而多肽、核酸等生物大分子对柱长的敏感程度较低。4.流速流速对于反相层析的影响是多方面的，一般来说，流速对于小分子的分离影响较大而大分子对流速变化敏感性较低。通常过高的流速会导致涡流扩散严重，影响样品在固定相和流动相之间的平衡，导致洗脱峰宽度变大分辨率下降；但过低的流速可能会导致样品组分纵向扩散加剧，也会使分辨率下降，且分离时间较长，不利于样品的稳定和较大规模的分离；5.温度温度对于反相层析的分离结果有较大的影响。提高温度能够降低流动相的黏度，增加传质速度，减少区带变宽现象，从而改善分辨率。但是在分离生物大分子的时候必须考虑到分子的稳定性，因此不宜用太高的温度。7.7反相层析五、高效液相色谱简介1.基本原理2.特点3.应用4.高效液相色谱仪的组成5.HPLC在蛋白分离中的应用及操作规程6.HPLC-RPC在蛋白分离中的应用举例7.7反相层析五、高效液相色谱简介高效液相色谱（HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC）与经典的色谱法（或层析法）的分离机制类似——混合物在流动相和固定相之间的分配系数不同，在两相中作相对运动时,经过反复多次的吸附-解吸的分配过程,各组分在移动速度上产生较大的差别,被分离成单个组分依次从柱内流出。1.基本原理7.7反相层析五、高效液相色谱简介HPLC在经典液相色谱的基础上，采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度的检测器，具有高分辨率、高灵敏度、速度快、自动化程度高等优点。3.应用HPLC被广泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分析等各种领域。高效液相色谱仪与结构仪器的联用是一个重要的发展方向。2.特点7.7反相层析五、高效液相色谱简介（1）高压输送系统（2）进样系统（3）分离系统（4）检测系统及记录系统4.高效液相色谱仪的组成7.7反相层析五、高效液相色谱简介溶剂贮存器：贮存流动相（1~2L）高压泵：将贮存器中的流动相连续送入色谱系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。压力：0~42MPa，流速：0.001~10ml/min。梯度洗脱装置：通过程序控制混合泵来使流动性的离子强度/pH/极性等发生梯度变化，提高分离效果和效率。4.高效液相色谱仪的组成——（1）高压输送系统7.7反相层析五、高效液相色谱简介六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。工作原理：①手柄装载(Load)位置时，样品经微量进样针从进样孔注射进定量环，定量环充满后，多余样品从放空孔排出；②将手柄转动至进样(Inject)位置时，阀与液相流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，推动样品进入液相分析柱进行分析。4.高效液相色谱仪的组成——（2）进样系统LoadInject7.7反相层析五、高效液相色谱简介柱管（柱壳）材质：玻璃柱、不锈钢柱柱长及柱内径：4.6mm×150mm/4.6mm×250mm（分析柱）柱内经25mm（制备柱）固定相（填料）类型：凝胶柱、离子交换柱、亲和柱和反相柱。孔径：根据样品分子量大小选择填料的孔径。分子量越小，孔径要求也越小；反之亦然。粒径：5μm（标准），3.0μm/3.5μm（短柱）4.高效液相色谱仪的组成——（3）分离系统7.7反相层析五、高效液相色谱简介检测器：类型：紫外、荧光、电导、pH等检测器。性能要求：灵敏度高、噪音低、线性范围宽、响应快及对温度和流速不敏感等。记录系统：样品被分离成单个组分后，依次从柱内流出,通过检测器时,样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来或在电脑上显示。4.高效液相色谱仪的组成——（4）检测系统及记录系统7.7反相层析五、高效液相色谱简介（1）色谱柱的选择：根据被分离蛋白的性质，选择适当的分离模式和不同规格和性能色谱柱。凝胶色谱反相色谱（2）样品液的准备：将分析样品转化为适合HPLC直接进样的样品。样品制备步骤：取材→匀浆→预分离→浓缩→溶解保持蛋白活性的措施：低温操作、添加蛋白酶抑制剂等提高蛋白溶解性的措施：适当加入表面活性剂、变性剂等在进样之前最好用0.45μm/0.22μm膜过滤。（3）流动相的选择：合适的极性、良好的选择性、与检测器匹配。pH的选择：梯度洗脱条件的选择有机改良剂的加入：三氟乙酸（TFA）流动相的配制：互溶性、微孔膜过滤5.HPLC在蛋白分离中的应用及操作规程7.7反相层析五、高效液相色谱简介6.HPLC-RPC在蛋白分离中的应用举例思考题1.反相层析的基本原理是什么？2.分析反相层析与疏水作用层析的区别与联系。3.高效液相色谱的原理和特点是什么？4.高效液相色谱仪有哪几部分组成？