8反相层析

BioPharm反相层析Reversedphasechromatography,RPC江南大学医药学院BioPharm反相层析概述原理反相层析介质反相层析的流动相层析技术应用BioPharm1概述反相层析法的建立追述到1950年，Howard和Martin用正辛烷作为固定相，水作为流动相进行石蜡油的液-液层析分离，并且把这种方法命名为反相层析所谓“正相”或“反相”，主要是指固定相和流动相的相对极性大小，反相层析因与传统分配层析刚好相反而得名，其固定相非极性强而流动相极性相对较高，样品中组分被洗脱的顺序是极性较高的组分先流出，极性较低的后被洗脱BioPharm反相层析流动相的溶剂洗脱强度变化范围大，使溶质保留值的差别可以达到1-2个数量级，因此反相层析可分离的溶质范围很宽，从极性较大的寡肽、小分子有机物到疏水性较强的生物大分子反相层析能够区分分子在疏水性质方面的细微差异而有效地进行分离，具备高分辨率的特性BioPharm2原理2.1反相层析作用原理疏溶剂理论（solvophobictheory）反相层析机理普遍被接受的是Horvath于1976年提出的疏溶剂理论，假设反相层析介质是表面均匀密集的覆盖着非极性配基的颗粒，溶质分子由于受到极性流动相的斥力而以其疏水部分结合至固定相的非极性配基上，除此之外溶质与固定相之间不存在其他任何相互作用BioPharm亲硅醇基效应（silanophilicinteraction）一定条件下硅胶表面残余的硅醇基能与溶质发生相互作用，包括：静电作用和氢键作用，从而对溶质的保留行为起决定作用;亲硅醇基效应常导致溶质保留值重复性差，洗脱峰脱尾等不良层析行为控制流动相pH，硅胶表面均匀覆盖非极性配基，屏蔽残余硅醇基，可基本排除亲硅醇基效应的影响;新型反相层析介质聚苯乙烯等高分子聚合材料的开发可根本消除亲硅醇基效应的影响。BioPharm2.2反相层析的分离过程BioPharm起始阶段：用具有合适pH、I和极性的流动相A平衡反相层析柱吸附样品：加样至层析柱，洗去未结合的溶质开始解吸：通过调节流动相极性等方式将反相介质上吸附的溶质顺序解吸完全解吸：移除前一步未解吸的物质再生：介质从100%流动相B重新过渡到流动相ABioPharm3反相层析介质3.1介质的构成基质：硅胶、聚苯乙烯等配基：正烷烃基团（n-烷基），常用的有辛基（C-8）和十八烷基（C-18），其他还包括丙基、丁基、丙基苯基、二苯基等BioPharm3.1.1基质硅胶优点：机械强度高，能承受高压、高流速，理化稳定性好，多孔性结构缺点：高pH条件下会溶解，并且会产生负电荷，对分离造成不良影响，只能在酸性条件下使用SiOHSiSiOBioPharm聚苯乙烯在强酸强碱性条件下稳定性好，不产生亲硅醇基效应BioPharm3.1.2配基正烷烃基–n-辛基–n-十八烷基–n-丙基–二苯基等3.1.3配基与基质的偶联用氯化三甲基硅烷或氯化三乙基硅烷封阻硅胶表面残留的硅醇基配基较大时，由于空间位阻效应，导致亲硅醇基效应存在BioPharm3.2反相层析介质的性质粒径–RPC是与HPLC技术伴随发展的，有着高分辨率，反相介质的粒径一般在5~30μm之间，小于常用的凝胶过滤介质和离子交换剂，有着较高的柱效–分析型应用：15μm介质–制备型应用：15μm介质孔径–通常在10～50nm之间，孔径的大小直接影响到有效结合容量，10nm左右孔径的介质分离小分子物质，孔径在30nm以上的介质分离生物大分子BioPharm配基密度–通常情况下反相介质有着较高的配基密度–当配基链长超过C6时，配基密度在同一数量级时对相对保留值的影响很小结合容量–每毫升反相介质能结合溶质的毫克数（mg溶质/mL介质），分为静态结合容量和动态结合容量–结合容量取决于溶质的分子大小、疏水性，介质的多孔性、配基密度，流动相的组成、pH，操作流速等机械强度–用最大操作压力（MPa）或最大线性流速（cm/h）表示稳定的理化性质BioPharm3.3常见的反相层析介质BioPharm3.3.1SOURCETMRPC系列基于聚苯乙烯的反相介质，用于肽、蛋白质、寡聚核苷酸等的分析型和制备型分离纯化，能够在高流速条件下实现对样品的快速、可重复、高容量和高分辨率分离根据介质的粒径不同，该系列包括SOURCE5RPC、SOURCE15RPC和SOURCE30RPC三个规格BioPharmSOURCERPC系列介质的主要特性BioPharmSOURCERPC良好的重复性优秀的放大能力优秀的流速/压力特性BioPharm3.3.2μRPCC2/C18系列是以粒径为3μm的多孔硅胶微粒为基质，键合二碳和十八碳的烷烃基团形成的反相介质具有非常小的粒径，具有很高的效率和优秀的分辨率，十分适合于用于肽谱分析，分析型和极微量纯化过程。以预装柱形式出售，有两种不同的规格–μRPCC2/C18PC3.2/30–μRPCC2/C18PC2.1/100BioPharmμRPCC2/C18反相层析柱的特性BioPharm3.3.3SephasilProtein/SephasilPeptide系列以多孔硅胶作为基质的，提供两种不同的粒径，分别是5μm和12μm，前者适用于高分辨率分析和纯化，后者适用于制备型纯化有三种不同配基，分别为C4，C8和C18，其疏水性依次增强SephasilProtein孔径较大，为30nm，允许蛋白质等生物大分子进入，因而适用于蛋白质的分离纯化；SephasilPeptide孔径较小，在10nm左右，更适合于较小的生物分子如肽类等的分离纯化BioPharmSephasil系列预装柱的特性BioPharm4反相层析的流动相流动相组成影响层析过程的容量因子和选择性，从而很大程度决定着Rs由多种成分组成的，其中包含水、一至两种的有机溶剂、调节pH的缓冲组分（酸）、调节溶质选择性的离子对试剂等，有时还需其它种类的添加剂分为流动相A（起始流动相）和流动相B（极限流动相），一般线性过渡BioPharm4.1有机溶剂又称为修饰剂（modifier），其作用是降低流动相极性，增强洗脱能力流动相A为水相或者有机溶剂体积分数较低的溶剂-水混合相，而流动相B则是有机溶剂体积分数较高的溶剂-水混合相甚至不含水的纯有机相要求是能够与水互溶，有较低的紫外截止波长和较低的粘度–截止波长：此波长下光程为1cm的纯溶剂的吸光度为1BioPharm反相层析中常用有机溶剂的部分性质BioPharm有机溶剂的种类直接关系到对样品组分的选择性，因此在分离效果不理想时，可以对溶剂的使用进行优化BioPharm反相层析的流动相大多采用二元系统，即由水和一种有机溶剂组成洗脱能力：甲醇乙醇乙腈1-丙醇2-丙醇根据分离实际需要，也可采用两种甚至两种以上的修饰剂构成三元、四元的流动相系统，以期获得合适的洗脱强度和最佳的选择性在分离多肽和蛋白质时应当慎用多元流动相，这是因为复杂的溶剂体系会导致多肽和蛋白质的沉淀和变性BioPharm4.2流动相的pH控制流动相pH的改变会影响到溶质的解离状态、固定相表面残留硅醇基和其它吸附基团的解离情况、以及添加至流动相的可解离组分的离子平衡，因此pH值的改变会引起溶质选择性和保留值的改变酸性条件常用三氟乙酸（TFA）、七氟丁酸（HFBA）和正磷酸调节pH，接近中性时常用乙酸铵或磷酸盐来调节pH，碱性条件用NaOH来调节控制BioPharm在（a）pH2和（b）pH12条件下分离血管紧张肽Ⅱ和血管紧张肽ⅢBioPharm反相层析流动相条件大多在低pH下（通常pH2～4之间），因为：很多样品组分在低pH下有较好的溶解性低的pH值抑制了样品组分中酸性基团及硅胶上硅醇基的解离由于目前还不明确的原因，多数蛋白质和肽类在低于其等电点的pH条件下操作可以获得更高的选择性在低pH时可采用低的离子强度，这样更易于回收样品BioPharm4.3离子对试剂离子对试剂也称为平衡离子，是通过离子作用与溶质分子结合，引起溶质疏水性质的改变，从而使得样品组分的保留值和选择性发生变化BioPharm离子对试剂中很多本身就是酸或碱，可同时起维持流动相pH的作用，典型的使用浓度范围是0.01%~0.1%或10~100mmol/L离子对试剂在高浓度有机溶剂中要有足够的溶解度，对波长220nm以上的紫外线不能有明显吸收在某些情况下，离子对试剂是溶质结合至反相介质所必需的BioPharm4.4其它种类的添加剂Brij：十二烷基聚氧乙烯醚BioPharm5层析技术反相介质和层析柱的选择流动相的选择和准备样品的准备和加样操作洗脱模式的选择和层析条件控制样品的检测和收集层析柱的再生、清洗和贮存BioPharm5.1反相介质和层析柱的选择5.1.1层析介质的选择选择依据：根据分离要求，包括规模和流动相条件样品组分的分子量和尺寸样品组分的疏水性样品组分的种类BioPharm根据分离要求–分辨率－介质的选择性（基质、配基种类）和柱效（介质粒径和层析柱的填充）–纯化规模－流速性能和结合容量（粒径）–流动相条件－介质的稳定性（基质）样品组分的分子量–结合容量－粒径和孔径BioPharm样品组分的疏水性–对样品中目标组分的疏水性强弱有个大致评估：疏水性弱的溶质，如氨基酸、寡聚核苷酸等，选用疏水性强的配基，如C18（十八烷基）；疏水性较强的溶质，选用疏水性较弱的配基，如C8（辛基）以下碳链的配基样品组分的种类–生物大分子虽然大多是亲水性，但稳定性较差，建议采用配基较短（C8以下）的介质BioPharm5.1.2层析柱尺寸的选择层析柱的尺寸由内径和柱长所界定，其取值主要取决于分离的规模和所需的分辨率内径–在柱长固定的情况下，内径决定了柱体积，RPC在放大层析规模时，都是在优化好层析条件后，固定柱长不变，增大层析柱内径来放大BioPharm加样量对Rs的影响BioPharm柱长反相介质粒径普遍较小，本身有着较高的柱效，一般所用层析柱柱长较短对于寡肽等生物小分子，适当增加柱长能够改善Rs生物大分子在反相柱中的保留值对于流动相的微小变化十分敏感，可以认为是由开/关机制控制，增加柱长不能明显改善RsBioPharm5.1.3层析柱的准备一般过程：以低速或中等流速用3CV的流动相B清洗层析柱以同样的流速在2~3CV内运行从100%流动相B到100%流动相A的线性梯度用至少5CV的流动相A平衡层析柱，直至所有信号达到稳定BioPharm5.2流动相的选择和准备生物分子RPC所用流动相常包含一种缓冲组分，一种修饰剂，有时还含有一种离子对试剂乙腈和甲醇是最常用的，条件摸索阶段以其中一种作为修饰剂，溶质在固定相上吸附较为牢固时，可考虑更换洗脱能力较强的修饰剂如异丙醇等溶质分子，特别是蛋白质等生物大分子在所用溶剂中的稳定性是须考虑的因素分离样品性质不明的情况下，一般流动相A为水相，不含修饰剂，而流动相B为100%有机相BioPharm反相层析多数在低pH条件下运行，流动相的pH通过添加一定浓度的酸来调节；往流动相中添加离子对试剂可以改变溶质的保留值和选择性，获得较好的分离效果；对于带正电荷的溶质应选择带负电荷的离子对试剂，如三氟乙酸等，对于带负电荷的溶质则应选用带正电荷的离子对试剂，如季铵盐等准备流动相时，所用到的各种试剂都应当是最高纯度级别的，所用的水也应是超纯水，添加了固体的流动相应当用0.22μm的滤膜过滤BioPharm5.3样品的准备和加样操作理想情况下应将样品溶于流动相A后加样，如样品在流动相A中溶解不好，可考虑添加有机酸、盐类等试剂来增加样品的溶解性，液体样品体积较小时可直接加样；样品在加样前应当通过10000g离心10min或用0.22μm微孔滤膜过滤除去任何可能存在的颗粒物；–对于组分特别复杂的样品，建议先用其它技术除杂反相层析柱通常是预装柱或带有可调接头的自装柱，连接于HPLC系