4小时51Cr释放法检测CMC活性

4小时51Cr释放法检测CMC活性4小时51Cr释放法检测CMC活性一、用51Cr铬酸钠标记靶细胞短期标记法1．用RPMI-1640培养液洗涤107靶细胞，去上清液。用0.5ml不含碳酸氢钠的完全培养液悬浮细胞。加入100μCi（3.7MBq）51Cr铬酸钠，37℃水浴中标记1小时，每5～10分钟摇晃一次，混匀细胞。2．如上用RPMI-1640培养液洗涤细胞3次，每次400×g10分钟。用50mlRPMI-1640培养液悬浮细胞，置37℃水浴30分钟，以减少非特异的自然释放。3．离心200×g10分钟，去上清液。小心用RPMI-1640培养液悬浮细胞，尽量减少振荡引起的细胞损伤以降低靶细胞的自然释放率，将细胞浓度调整为0.5×105或1×105/ml备用。二、4小时51Cr释放实验1．在96孔圆底细胞培养板中加入51Cr标记的靶细胞，每孔加100μl。2．向各孔加100μl效应细胞，效应细胞与靶细胞的比例（效靶比，E：T）根据要求而定，通常为5：1～20：1。阴性对照孔（自然释放）不加效应细胞只加100μl完全培养液，阳性对照孔（最大释放）中加100μ1％NP40（或2％SDS，1mol/L盐酸）。每个实验置三个复孔。3．稍稍离心（100×g3分钟）后，置37℃5％CO2的二氧化碳培养箱中培养4小时。4．离心培养板200×g10分钟，每孔吸出100μl上清液置一次性使用的检测管中，在γ－计数仪上（或液闪计数仪上）测定上清液中的每分钟放射性活性（cpm值）。3）特异性杀伤活性的计算1．用细胞毒性百分比表示：细胞毒性（％）＝[（实验组cpm－自然释放组cpm）/（最大释放组cpm－自然释放组cpm）]×100％2．用溶解单位（lyticunit，LU）表示：一个LU是指能溶解一定数量靶细胞的效应细胞数。通常将能溶解30％靶细胞的效应细胞数定位一个LU。结果以106个效应细胞所具有的LU数表示：LU30/106细胞＝106/[（E：T30）×（每孔靶细胞数）]E：T30是该效靶比时效应细胞能杀伤30％靶细胞51Cr释放试验测定NK细胞活性【基本原理】Na251CrO4能进入到增殖的细胞内，与细胞浆蛋白质牢固地结合。当标记的51Cr细胞受到损伤或死亡之后，即可释放出51Cr。51Cr辐射γ射线，通过测定受损伤或死亡靶细胞释放到上清中的51Cr，即可计算出NK细胞活性。【试剂及材料】（1）铬酸钠（Na251CrO4）:51Cr的物理半寿期为27.72d。（2）十二烷基硫酸钠（SDS）:用无菌生理盐水配制成2％浓度。（3）靶细胞:检测人的NK细胞活性常用的靶细胞为体外传代细胞株K562。检测小鼠NK细胞活性常用的靶细胞是YAC-1细胞株。实验时一般采用24～48h培养的靶细胞。（4）效应细胞:从人外周血（肝素抗凝）分离的单个核细胞或小鼠脾细胞。（5）含15％NCS的RPMI-1640营养液及淋巴细胞分层液等。【操作方法】（1）靶细胞的制备:取培养24～48h的靶细胞2×106/0.5ml，加入100～200μci51Cr，置37℃水浴90min，每间隔15min振摇一次。然后用含5％NCS的RPMI-1640培养液洗涤三次，除去游离的51Cr。计数活细胞，用完全RPMI-1640培养液调整细胞浓度至1×105/ml，如暂时不用，可放置4℃冰箱内保存。同时应检测细胞的51Cr标记率，一般要求标记率〉0.1cpm/细胞；（2）效应细胞的制备:常规方法分离PBMC或小鼠脾细胞，用完全RPMI-1640培养液配制成1×107/ml的细胞悬液备用；（3）效—靶细胞作用:在无菌操作条件下，取效应细胞和靶细胞各0.1ml（E/T=100:1），加入96孔培养板内，每份标本做3复孔。同时设自然释放对照孔（0.1ml靶细胞+0.1ml完全RPMI-1640培养液）和最大释放孔（0.1ml靶细胞+0.1ml2％SDS），放置37℃、5％CO2温箱内孵育4h，取出后用微量移液器吸出各孔上清0.1ml，加于小塑料试管内（勿将细胞吸出），用γ计数仪测量cpm值；（4）结果计算:根据下式计算51Cr自然释放率和NK细胞活性:自然释放对照孔cpm均值51Cr自然释放率（％）=───────────×100％最大释放对照孔cpm均值试验孔cpm均值-自然释放对照孔cpm均值NK细胞活性（％）=──────────────────×100％最大释放对照孔cpm均值注：一般要求51Cr自然释放率10％流式细胞仪检测细胞凋亡——AnnexinV/PI双染色法BIOX.CN2005-8-1218:19:22来源：生命经纬基本原理细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，目前早期识别仍有困难。这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。AnnexinV是一种Ca+依赖的磷脂结合蛋白，最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白，AnnexinV具有易于结合到磷脂类如PS的特性。对PS有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以建立一种用AnnexinV结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。试剂与仪器孵育缓冲液：10mmol/LHEPES/NaOH，PH7.4，140mmol/LNaCl，5mmol/LCaCl2标记液：将FITC-AnnexinV（宝灵曼公司产品）和PI加入到孵育缓冲液中，终浓度均为1ug/ml流式细胞仪实验步骤1.细胞收集：悬浮细胞直接收集到10ml的离心管中，每样本细胞数为（1~5）×106，/mL500~1000r/min离心5min，弃去培养液。2.用孵育缓冲液洗涤1次，500~1000r/min离心5min。3.用100ul的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10~15min。4.500~1000r/min离心5min沉淀细胞孵育缓冲液洗1次。5.加入荧光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动。6.流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI。7.结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。流式细胞仪检测细胞凋亡——Heochst33342/PI双染色法BIOX.CN2005-8-1218:17:40来源：生命经纬基本原理经固定的凋亡细胞其染色体荧光染料的DNA可染性性下降。细胞一经固定就不再是活细胞，而且细胞固定过程对细胞膜的通透性也有影响。因此发展了用“细胞活性”鉴定染料染色的流式细胞仪检测方法。这些方法细胞不经固定就直接用DNA染料染色，且染料的浓度要比固定细胞所用的浓度要低得多。流式细胞仪通常根据细胞膜完整性将细胞分为“活细胞”和“死细胞”，因此正常细胞和凋亡细胞归为活细胞。活细胞染料如Hoechst33342能少许进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作用。Hoechst33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高，Hoechst33342在凋亡细胞中的荧光强度增高的机制与凋亡细胞膜通透性发生改变有关，凋亡细胞早期细胞膜的完整性没有明显性改变，但细胞膜的通透性已有增强，因此进入凋亡细胞中的Hoechst33342比正常细胞的多。此外，还与凋亡细胞的染色体DNA的结构发生了改变从而使该染料能更有效地与DNA结合以及凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到损伤不能有效地将Hoechst33342排出到细胞外使之在细胞内积累增加等有关。既然Hoechst33342进入凋亡细胞中比正常细胞更容易，而EB、PI或7-AAD等染料是不能进入细胞膜完整的活细胞中，即正常细胞和凋亡细胞在不经固定的情况下对这些染料是拒染，坏死细胞由于膜完整性在早期即已破损，可被这些染料染色。根据这些特性，用Hoechst33342结合PI或EB等染料对凋亡细胞进行双染色，就可在流式细胞仪上将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区别开来。在双变量流式细胞仪的散点图上，这三群细胞表现分别为：正常细胞为低蓝色/低红色（Hoechst33342+/PI+），凋亡细胞为高蓝色/低红色（Hoechst33342++/PI+），坏死细胞为低蓝色/高红色（Hoechst33342+/PI++）。试剂与仪器染液：用PBS配成10ug/ml的储存液浓度，4℃避光保存；染液：用PBS配成5ug/ml浓度，4℃避光保存。目的筛网流式细胞仪实验步骤1.悬浮生长的细胞在培养的状态下加入Heochst33342，终浓度为1ug/ml；37℃孵育7—10min。2.低温500~1000r/min离心5min弃去染液。3.加入1.0mlPI染液，4℃避光染色15min。4.400目的筛网过滤1次。5.流式细胞仪分析：Heochst33342用氪激光激发的紫外线荧光，激发光波波长为352nm，发射光波波长为400~500nm，产生兰色荧光；PI用氩离子激光激发荧光，激发光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光。分析兰色荧光对红色荧光的散点图或地形图。6.结果判断：在兰色荧光对红色荧光的散点图上，结果为：正常细胞为低蓝光/低红光，凋亡细胞为高蓝光/低红光，坏死细胞为低蓝光/高红光。注意事项1.在红色荧光对兰色荧光散点图上，还可见到细胞凋亡区向细胞坏死区迁移的轨迹，可能是凋亡细胞的DNA进一步降解的缘故。2.用Heochst33342染料与细胞孵育的时间不宜过长，一般控制在20min之内为宜。如果太长可引起Heochst33342的发射光谱由蓝光向红光的迁移，导致红色荧光与兰色荧光的比例改变，从而影响结果的判断。流式细胞仪检测细胞凋亡——PI单染色法BIOX.CN2005-8-1218:15:45来源：生命经纬基本原理其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面：1.细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。2.光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来