流式细胞术在临床血液学

流式细胞术在临床血液学与医学科研中的应用陈军浩南京大学医学院附属南京鼓楼医院2流式细胞仪基本工作原理•光路系统•液路系统•电路系统3流式细胞仪光路图4外周血FSC-SSC点图5荧光信号（FL1、FL2、FL3）6滤光片7CD8-CD28+CD8-CD28-CD8+CD28+CD8+CD28-FL1-FL2点图8红系成熟过程抗原表达9B系成熟过程抗原表达10T系成熟过程抗原表达11粒系成熟过程抗原表达12单系成熟过程抗原表达13急性白血病免疫分型•髓系标志：CD13、CD33、CD14、CD117、CD61、胞浆MPO。•B系标志：CD19、CD10、CD22、CD20、胞浆CD22。•T系标志：CD5、CD7、胞浆CD3。•红系标志：CD71、GlyA•非系列标志：CD34、HLA-DR14白血病细胞系列不保真性•抗原跨系表达•抗原表达不同步•抗原表达过高、过低•表达异常蛋白KORSA3544(CD66c)15CD19白血病细胞伴CD33表达16细胞抗原表达过高、过低17AML-M0/M1•有低的SSC和FSC。在CD45－SSC图上出现在原始细胞位置上，至少表达一个特异性标志如CD13或CD33，但MPO比CD13与CD33更灵敏。也可表达CD7或CD4。HLA-DR、CD34阳性，有些研究表明CD7与CD34共表达在AML且预后差。•流式上M1与M0相似不易区分，M1一般CD13＋、CD33＋，但CD34表达可少于M0，可能表达部分CD15。1819AML-M2•M2与M1的主要区别是成熟度增加，原始细胞减少，CD15表达较M1显著，CD34弱于M1。•CD45-SSC图显示从髓系blast区至成熟骨髓细胞区的连续细胞带，CD45－SSC图有助于确定blasts比例。2021AML-M3•高颗粒性，表现为较高的SSC，多数情况HLA-DR阴性或表达很少，CD34少于M2、一般CD13弱于CD33，大多表达CD117。•M3v低颗粒性，表现为较低的SSC。222324AML-M4/M5•两型表型相似，但M4较M5表达更多的CD34（＋），CD45-SSC图上，不成熟细胞出现在单核区，重要的表型为CD13、CD33、HLA-DR、CD14和CD15，CD33可表达强于CD13。252627AML-M6•特征不明显，HLA-DR，CD34、CD13、CD33、CD19、CD22、CD5、CD7等均阴性，CD45－SSC图显示主要为CD45阴性区域为红系成份，高表达CD71。2829AML-M7•巨核细胞白血病，在AML中少于1％。一般CD61（GpⅢa）和/或CD41（GpⅡb-Ⅲa）阳性，特别而注意由于血小板粘附在blasts上造成的假阳性，3031B-ALL32B-ALL33淋巴细胞增生性疾病34浆细胞白血病35浆细胞白血病36T-细胞白血病37T-细胞白血病胞浆CD3阳性38慢性淋巴细胞白血病39套细胞淋巴瘤40边缘带B细胞淋巴瘤4142吞噬、加工、递呈抗原43细胞吞噬功能检测•DEX（Dextrans，右旋糖苷）。•37℃，DEX-FITC与活细胞共孵育10min。•洗去细胞外多余的DEX-FITC。•流式细胞仪检测FL1荧光强度的变化。44细胞吞噬功能检测45细胞吞噬功能检测的意义•单核吞噬细胞系统是机体的最初防御系统，有清除或吞噬异物的能力。本试验可评价此系统的功能。•癌症患者细胞吞噬功能减低。•研究免疫抑制药物对细胞的作用。46呼吸爆发ConAAAPAFIL-8fMLP酪氨酸激酶表面受体G蛋白NADPHoxidaseO2----O2-47中性粒细胞呼吸爆发•肝素抗凝血。•调理后的细菌为刺激剂；PMA为强刺激剂；fMLP为弱刺激剂。•37℃，刺激后细胞与二氢罗丹明（DHR）123孵育。•流式细胞仪检测FL1荧光强度。48中性粒细胞呼吸爆发49呼吸爆发的意义•慢性肉芽肿症（chronicgranulomatousdisease,CGD），患者的中性粒细胞和单核细胞吞噬细菌后不能产后呼吸爆发，不能杀灭摄入的致病菌。•超氧阴离子可造成正常组织损伤。如类风湿关节炎。50APC与T细胞的作用51移植前后CD3阳性T细胞CD4/CD8细胞的表达52移植前后CD3阳性T细胞CD8/CD28的表达53移植前后CD4阳性细胞CD45RA/CD45RO的表达54人淋巴细胞CD154的表达55Th1/Th2细胞检测（三色法）正常人MS患者56Th1/Th2细胞检测（四色法）57特异性抗原激活淋巴细胞58移植后免疫检测•CD25较基础值高出10%，表明即将或已经发生排斥。•HLA-DR增加10%，且不伴有CD25增加，提示巨细胞病毒感染。•CD4/CD8小于0.2必须停用免疫抑制剂。59捕获微球细胞因子检测抗体流式细胞术检测可溶性抗原60M:1-6分别代表：IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、TNF-a、INF-γ61流式细胞术CBA可溶性细胞因子检测，自上而下依次为：IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，TNF-a，IFN-v62MHCⅠ四聚体模式图•每条MHC接有一个生物素•链亲和素结合四个生物素•微球蛋白维持MHC正确构象•肽提供特异性结合•四聚体较单体与CTL结合稳定63BasicPentamerStainingProtocolRedcelllysingsolution-5minsMHCPentamer(e.g.R-PE)anti-CD8mAb(e.g.FITC)30’-45’(tempdependent)2xwashes+CD8Pentamer20’64MHCⅠ四聚体技术的意义•四聚体复合物法具有精确的肽特异性。•阳性细胞数量与CTL功能密切相关。•分选出正染组细胞扩增，其阳性率由4%上升为90%；负染组仍为阴性。•HBV肝内出现大量非HBV特异性淋巴细胞浸润。•免疫接种效果监视。65效应细胞对靶细胞的杀伤作用•预先用CFSE染色K562靶细胞（发绿色荧光）。•效应细胞与靶细胞相互作用。•用碘化吡啶（PI）染色混合的细胞。•活细胞拒染PI。死细胞膜透性增加，PI进入胞内与DNA着色，呈红色。66效应细胞对靶细胞的杀伤检测67细胞DNA含量分析•碘化吡啶与DNA结合发出红色荧光。•荧光强度与DNA含量正比。•S期细胞DNA正在合成。•G0/G1期细胞DNA为G2/M期的一半。•异倍体细胞出现提示恶性细胞。68流式细胞术分析细胞DNA含量69BrdU掺入实验•BrdU是类似于胸腺嘧啶脱氧核苷，在细胞增殖时可掺入DNA链中。•用酸/碱/酶使DNA链解开。•荧光素标记的抗BrdU单抗孵育。•加入PI。•流式细胞仪检测。70BrdU掺入实验71CFSE观察细胞增殖•CFSE(CarboxyfluoresceinSuccinimidylester)是脂溶性染料，可以被细胞膜摄取。•在488nm激发波长，发出绿色荧光。•细胞有丝分裂后，染料平均分配到两个子代细胞中。•流式细胞仪检测，荧光强度下降。72CFSE标记的ECV304细胞共聚焦显微镜73荧光染料CFSE作为细胞标记图2CFSE标记ECV304细胞增殖对平均荧光强度的影响0200400600800100012001400160018002000123456时间（天）荧光强度0510152025细胞计数(×104)74T细胞CFSE染色后PMA刺激75多参数CFSE染色B细胞增殖76流式细胞术计数淋巴细胞亚群77单个核细胞诱导树突状细胞78单个核细胞诱导树突状细胞79外周血中DC1、DC2检测•DC1增强免疫应答能力。•DC2主要参与免疫调理。•外周血中DC的确认标准为：1.Lin-（CD3、CD14、CD20、CD19、CD56、CD16）、HLA-DR+2.DC1为髓样DC，表达CD11c。3.DC2为淋巴样DC，表达CD123。80外周血中DC1、DC2检测81HBV患者DC1、DC2变化00.050.10.150.20.250.3健康人慢性乙肝HBV肝硬化DC1(%)DC2（%）82间充质干细胞表面标志83研究间质干细胞的意义•具有很强的自我更新能力、多向分化潜能，还具有相当强的可塑性。•支持、改善造血微环境。•免疫调节，诱导免疫耐受。•基因治疗载体细胞。•作为研究细胞增殖分化的细胞模型巨大的临床应用前景84凋亡检测•Fas(CD95)/FasL检测。•Bcl-2、COX-2、CX43等检测。•磷脂酰丝氨酸(PS)在细胞外膜上的检测。•线粒体膜电位变化的检测。•TUNEL检测。•DNALadder检测。85流式细胞术分析细胞DNA含量86Annexin-V/PI检测细胞凋亡87JC-1染色线粒体膜电位887-AAD染色检测细胞凋亡89研究化疗药物协同作用90胞浆钙离子检测•钙离子是将信号由胞膜转入胞浆必需的。•胞浆钙离子增高，表示细胞对刺激产生了应答。•胞浆钙离子可以是胞外进入的，也可以是内部释放的。•流式细胞仪结合荧光物质可以观察此现象。如fluo-3-AM。91细胞胞浆钙离子测定92CpG-ODN的免疫刺激作用•CpG基序（motif）或者称为免疫刺激序列（immunostimulatoryaequences,ISS）是指非甲基化胞嘧定－鸟嘌呤（CpG）两侧具有特定碱基的双脱氧核苷酸序列。•来源于细菌DNA，也可人工合成，高效、安全。•通过TLR-9刺激免疫细胞，发挥作用。•靶细胞为DC2和B淋巴细胞。93实验方法•CpG2006、2216由上海生物工程技术服务有限公司合成，全硫代化修饰。•对照组为含10%FCS的RPMI1640培养外周血PBMC，细胞量107，37℃、5%CO2、48小时。•实验组加入CpG2006或CpG2216，终浓度均为1umol/mL，余同上。94对照组淋巴细胞CD69表达95CpG2006诱导细胞CD69表达96CpG2216诱导细胞CD69表达97CpG-ODN诱导T、B淋巴细胞CD69表达05101520253035对照Cp2006CpG2216对照CpG2006CpG2216CD69表达率（%）T淋巴细胞B淋巴细胞98CpG诱导B淋巴细胞CD80与CD86表达99CpG诱导B淋巴细胞CD80与CD86表达01020304050607080对照Cp2006CpG2216对照CpG2006CpG2216CD80CD86图CD80CD86CD80、CD86表达率（%）100对照组B淋巴细胞MHC-Ⅰ与MHC-Ⅱ表达101CpG2006诱导B淋巴细胞MHC-Ⅰ与MHC-Ⅱ表达102CpG2216诱导B淋巴细胞MHC-Ⅰ与MHC-Ⅱ表达103CpG诱导B淋巴细胞MHC分子表达05001000150020002500对照Cp2006CpG2216对照CpG2006CpG2216MHC-ⅠMHC-Ⅱ图2、CMHC表达量（MFI）104对照组单个核细胞周期分析105CpG2006诱导单个核细胞周期106CpG2216诱导单个核细胞周期107谢谢！