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1实验5高效液相色谱应用实验一、实验目的1、熟悉高效液相色谱分离分析的原理。2、掌握根据保留值，用已知纯物质对照定性的分析方法。3、掌握用归一化法定量测定混合物各组分的含量。4、掌握用微量进样器进样的基本操作和色谱软件的一般操作。二、方法原理高效液相色谱法是一种重要的色谱分离技术。根据所用固定相和分离机理的不同，一般将高效液相色谱法分为分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱等。在分配色谱中，组分在色谱柱上的保留程度取决于它们在固定相和流动相之间的分配系数K：组分在固定相中的浓度K=————————————组分在流动相中的浓度显然，K值越大，组分在固定相上的保留时间越长固定相与流动相之间的极性差值也越大。因此，出现了流动相为非极性而固定相为极性物质的正相色谱法和流动相为极性而固定相为非极性的反相色谱法。目前应用最广的固定相是通过化学反应的方法将固定液键合到硅胶表面上，即所谓的键合固定相。若将正构烷烃等非极性物质（如n-C18烷）键合到硅胶基质上，以极性溶剂（如甲醇和水）为流动相，则可分离常用的有机化合物。三、仪器与试剂高效液相色谱仪、紫外（254nm）检测器、色谱柱C18柱（250mm×4.6mm）、注射器（25μL）流动相甲醇+水（使用前应超声波脱气）、甲苯、苯甲醇、苯甲酸（均为分析纯）、未知混合样品（甲苯、苯甲醇、苯甲酸的混合溶液）四、实验步骤1.以流动相为溶剂，配制甲苯、苯甲醇、苯甲酸的标准溶液，浓度均为10mg/mL。2.在老师的指导下开启液相色谱仪，设定操作条件。3.待仪器稳定后，分别用注射器进甲苯、苯甲醇、苯甲酸溶液各5μL，进样的同时，要作好记录保留时间。4.进未知混合样品5μL，记下各组分色谱峰的保留时间。5.以标准物的保留时间为基准，给未知样品各组分定性。6.根据标准物的峰面积，估算未知样品中相应组分的含量。2五、问题讨论1.解释未知混合样品中各组分的洗脱顺序。2、若实验中的色谱峰无法完全分离，应如何改善实验条件？3、高效液相色谱仪由哪几大部分组成？4、紫外光度检测器是否适用于所有的有机化合物，为什么？六、注意事项1、为获得理想的分离效果，保持较低的柱压力降，准确控制流动相的流量，防止微米级的机械杂质阻塞流路是实验操作中的关键。2、必须掌握溶剂的纯化技术，样品最好用针头式过滤器（复杂样品事先要经过预处理），流动相须经0.45微米以下滤膜过滤。