PCR技术在食品安全检测中的应用

PCR技术在食品安全检测中的应用姓名宁馨学号2009132137专业生物技术班级093班二〇一一年十二月PCR技术在食品安全检测中的应用姓名：宁馨指导老师：武晓英（太原师范学院生物系093班学号2009132137）[摘要]:食品是人类赖以生存和发展的物质基础，而食品营养、安全问题是关系到人体健康和国计民生的重大问题，近年来,已经引起了人们的高度重视.有关食品安全检测的技术也因此受到重视,其中PcR技术以其灵敏度高、特异性强以及快速准确等优势在食品检测领域得到愈来愈广泛的应用.本文主要介绍了PCK技术检测食品微生物的优点，分析了PCR．技术在食品检测中的应用及一些新的PCR检测技术，并进一步说明了这些技术在食品微生物检测中的发展和应用。[关键词]:多聚酶链式反应PCR食品检测食品安全微生物1．PCR技术的原理聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction，PCR)，又称无细胞克隆技术(FreeBacteriaCloningTechnique)，是一种根椐生物体内DNA复制的某些特点而设计的，在体外对特定DNA序列进行快速扩增的技术。自美国Cetus公司人类遗传室KaryMullis及其同事于1985年发明聚合酶链式反应(PCR)以来，PCR技术及其相关技术就以惊人的速度发展起来，在多种核酸检测技术中都得到了广泛的运用。PCR反应体系主要由寡核苷酸(引物)、4种dNTP、TaqDNA聚合酶、靶序列DNA和PCR反应缓冲液体系组成，它改变了传统分子克隆技术的模式，不通过活细胞，而是将扩增建立在三步重复发生反应的基础上：①通过热处理将双股DNA变性裂解成单股DNA；②退火延伸引物至特异性寡核苷酸上；③酶促延伸引物与DNA配对合成模板，引物退火，变性DNA片段，引物杂交形成的模板可参与再次反应。(图1)溶液中核苷酸通过聚合酶的作用形成互补的DNA片段，并能重新裂解成单股DNA，成为下次PCR复制的模板。因而每次循环特异性DNA片断将以双倍量增加，典型扩增经过20-40次循环能引起100万倍的扩增，大大提高了DNA的得率。因此，当知道待检病原具有某一特定基因片段时，即可利用特异性的引物对样品中微量的目标DNA进行PCR扩增，增加靶DNA数量，使其达到足够的检测量(图2),通过电泳检测扩增出的特定片断，即可确定感染的病原。[1]2．PCR技术的发展2.1常规PcR检测对细菌进行分类鉴定的常规PCR技术，主要是以高度保守的特定基因序列的基础上建立起来的，如核糖体RNA(rDNA)、gyrB基因、toxR基因等。自6O年代末，Woese首次运用rDNA分析生物的系统发育以来，rDNA数据库快速扩大，已成为细菌多样性、系统进化与发育研究广泛采用的序列。细菌的16SrDNA基因核苷酸序列具有高度保守性，它的序列变化与进化距离相适应，被称为一种进化分子钟。由于其进化速度大约是每五千万年发生1％的碱基变化，所以适用于种以上水平的鉴定。研究细菌16SrDNA最直接的方式就是通过基因测序并与Genbank、EMBL、DDB等国际通用的数据库比对，根据同源性的大小确定细菌种的归类。23SrDNA基因也是非常保守的序列，由于它与16SrDNA基因是线性串联排列，在此基础上就发展出利用16S-23SrDNA基因间区序列来对细菌进行鉴定的方法。这个基因区段的进化速度高于16SrDNA，因此可以发展成为细菌种甚至株的鉴定方法。除此以外，还有其它一些高度保守的序列，如gyrB基因(细菌中广泛存在的一种编码DNA的拓扑异构酶Ⅱ的B亚基的单拷贝基因)、toxR基因(弧菌中的毒素表达调控蛋白基因)等也越来越广泛的被用于对病原性细菌进行分子生物学鉴定。2.2多重PCR技术多重PCR技术是在常规PCR基础上改进并发展起来的一种新型PCR扩增技术，其检测原理与传统PCR相同.如果存在与各引物对特异性互补的模板，只不过是在同一反应体系中加入1对以上的特异性引物，那么就可以同时在同一个反应管中扩增出l条以上的目的DNA片段。使用这一方法可以同时检测1个以上目的基因或者借助其交叉限制进行确认。，可同时检测多种病原微生物。该技术自1988年Chamberlain首次应用于杜氏营养不良症(Duchennemusculardystrophy)基因外显子缺失的检测以来，已经在遗传病诊断、转基因鉴定、病原体检测等各个领域成功的得到应用。[2]2.3免疫一PCR免疫PCR是Sano等在1992年首创，其关键在于用一个连接分子将一段特和DNA分子之间建立相对应关系，将对蛋白质的检测转化为对核酸的检测，从而可以运用PCR的高度敏感性来放大抗原抗体反应的特异性，由PCR反应产物的量反映抗原分子的量。[3]2.4反转录PCR反转录PCR是指在PCR扩增之前，先用DNA酶破坏样品中的DNA，再在混合液中加入逆转录酶和随机引物(常为六个碱基)，即可将样品中的mRNA和rRNA逆转录成cDNA，然后再扩增特定的目的基因序列.2.5实时荧光PCR实时荧光PCR技术将PCR和核酸杂交以及荧光信号放大结合同步进行；与常规PCR相比，该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且由于结合了PCR技术的高灵敏度和核酸杂交技术的特异性，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题等特点，目前已在国内外广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。实时荧光PCR技术实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，在扩增的同时进行检测，不需要PCR后处理，不仅避免了交叉污染机会，而且大大节约了检测所需的时间。3.PCR技术检测食品微生物的优点3.1方便性操作烦琐，自动化程度不高是传统检测方法的一大缺点。传统的检测方法往往需要花费大量的人工来实现。适合不同微生物生长的培养基以及不同微生物适宜生长的pH、温度等都需要花费一定的人力和时间，观察菌落特征、细胞特征、革兰氏染色以及生理生化鉴定等步骤烦琐。因此，落后的检测方法与高自动化的现代企业形成鲜明的对比，极大地限制了现代化食品企业的发展。而PCR技术检测食品微生物操作简单、方便，仅用一人就能完成检测，具有极大的方便性。3.2快捷性传统的检测方法最大的缺点就是检测需要时间长，一般的腐败菌检测至少需要2到5天，甚至7天以上。检验结果出来时往往产品已经流向市场，对实际生产具有严重的滞后性。而PCR技术检测食品微生物能在一天之内检测出结果．甚至在几个小时就检测出结果，对食品工业生产具有很好的指导作用。3.3准确性食品中污染微生物种类很多，即使是同一种食品中微生物种类也有很多，用传统的方法检测食品中微生物要分离出所有的微生物很困难。特别是在检测食品中的弱势菌时．可能很难用传统的方法检测出来，特别是有些微生物很难培养，而用PCR技术检测这些微生物可以避免这些问题。因此．利用PCR技术能够比较准确地检测食品中微生物。[4]4.PCR检测食品微生物的主要流程4.1引物设计引物的优劣直接关系到PCR扩增的特异性与成功与否，PCR引物对扩增的逐渐明了，使得引物设计变得更为容易。设计的准确性则取决于对所检测对象的遗传背景的了解。4.2模板的制备PCR检测方法的可靠性一部分依赖于目标模板的纯度与充足的目标分子数量，绝大部分PCR检测依旧要求富集步骤。食品中有相当多PCR抑制因子，要尽可能地除去(包括DNA提取时蛋白与有机溶剂等的去除)，这一步的好坏直接影响最终检测结果。不管是在提取微生物的核酸，亦或是直接处理食品样品，模板的制备都很重要，尤其是直接处理样品时.5.PCR技术在食品致病菌检测中的应用传统方法检测食品中致病菌的步骤繁琐费时，需经富集培养、分离培养、形态特征观察、牛理生化反应、血清学鉴定以及必要的动物试验等过程，并且传统方法无法对那些难以人工培养的微生物进行检测。而应用PCR技术，只需数小时，就可以电泳法检测出0.1mgDNA中仅含数个拷贝的模板序列；用PCR扩增细菌中保守的rDNA片，还可对那些人工无法培养的微生物进行检测。利用PCR检测食品中的致病菌，首先要富集细菌细胞，通常经离心沉淀、滤膜过滤等方法可从样品中获得细菌细胞，然后裂解细胞，使细胞中的DNA释放，纯化后经PCR扩增细胞靶DNA的特异性序列，最后用电泳法或特异性核酸探针检测扩增的DNA序列。5.1检测沙门氏菌近年来，用PCR技术检测沙门氏菌得到了迅速发展，产生了许多种PCR法。如常规PCR、套式PCR、多重PCR。也可几种方法结合使用，将常规PCR与半套式PCR相结合，根据沙门氏菌中保守的16SrRNA基因为模板设计了一对引物，扩增的片段为555bp。经过优化设计反应条件，只对沙门氏菌产生特异扩增，敏感性达30cfu。为了对扩增结果进行鉴定，又在这两条引物之间设计一条半套式引物。经半套式PCR检测证明第一次产物是正确的，且灵敏度提高至3cfu。此外，还可将PCR与微孔板检测、与ELISA技术、与探针杂交有机结合起来。5.2检测单核细胞增生李斯特菌李氏溶血素O基因与内化素基因是单核细胞增生李斯特菌最主要的致病因子与侵袭因子，这两个致病基因的位点均在染色体上。溶血素由hlyA基因编码，且hlyA基因在该菌中保守。根据发表的单核细胞增生性李斯特菌的重要毒力基因hlyA的全基因序列，设计出引物，建立了该菌的PCR诊断方法，结果显示扩增可获得预期743bp的片段，且扩增具有极好的种特异性。同时，实验结果表明，用食品标本检测时，许多复杂成分含抑制Tag酶的活性，当经过增菌培养，并对培养物进行化学抽提，去除样品中的脂类和蛋白质，纯化的菌体经加热裂解后直接用作PCR反应模板，可大大提高检出率。5.3检测金黄色葡萄球菌随着基因探针和PCR技术的应用和发展，使金黄色葡萄球菌肠毒素的诊断检测发生了一次飞跃。目前主要是利用聚合酶链反应技术(PCR)，对金黄色葡萄球菌肠毒素中的较常见的、耐热的B基因(SEB)进行检测。由于快速诊断往往不宜用纯培养物而是用原始样品，因此易混人大量杂菌，为了确定此方法的特异性，采用大肠杆菌作为干扰菌进行PCR检测，实验证实了杂菌在比靶细菌高出万倍的情况下，也不影响细菌的检测，因而本实验采取的PCR方法检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素B基因，既快速(24h即可报告结果)、准确、特异性强，同时可以提高检出率，节省检测时间，又可节省人力和物力。[5]6.水产养殖动物细菌性病原检测随着我国水产养殖规模的不断扩大和集约化水平的提高，各种水产养殖动物病害的发生日益频繁，危害也越来越严重，己成为制约整个水产养殖业发展的最重要的因素之一。近年来，寻求水产动物病害的有效防治方法越来越受到国内外学者的广泛关注，其中水产养殖动物病原的快速、准确检测是对水产动物病害进行有效防治的基础和先决条件。随着分子生物学的迅速发展，PCR技术在水产养殖动物病原菌诊断中的应用越来越广泛。许多学者致力于通过PCR技术对致病菌进行快速检测研究工作，目前国内外已建立了不少用PCR技术检测水产病原菌的方法。邓先余[6]等建立了副溶血性弧菌16S．23SrDNA基因间区序列的PCR技术。Makino等已经完成副溶血弧菌的基因组测序，从而使副溶血弧菌毒力基因及特异的基因序列得到进一步确定。根据副溶血弧菌特异基因序列，设计引物，进行PCR检测，是现阶段检测副溶血弧菌的最快速准确的方法。Lee等采用了PCR技术对创伤弧菌进行鉴定。JongsikChun等利用16S-23SrRNA基因间区序列的保守性，建立了鉴定拟态弧菌的PCR技术。战文斌[7]等采用Kimura引物，用PCR技术对不同生长时期的中国对虾进行鳗弧菌的检测。余俊红[8]等以鳗弧菌的金属蛋白酶基因为目标基因，设计引物用PCR方法成功地检测出鳗弧菌。彭宣宪[9]等采用细菌的16SrRNA基因保守区特异引物，以嗜水气单胞菌、鲁克氏耶尔森菌和鳗弧菌等6种常见病原菌为对象，建立了PCR-SSCP技术，能完成对多个病原的同时检测，特异性好且快捷经济。7.PCR技术快速鉴别肉质品目前常用的肉种类鉴别方法有形态学、免疫学和聚合酶链反应等方法。这些方法对不同动物的生鲜肉有一定的鉴别作用