色谱分析方法

现代化学化工实验技术和分析方法色谱分析方法一、色谱分析法概述色谱分析法已成为当代科技迅速发展时期的最适宜的最重要的分离分析方法，形成了一门新兴学科――色谱法。气相色谱、液相色谱、凝胶渗透色谱、离子色谱等都得到了广泛深入的应用。色谱法的独到之处在于它的高分离效能，实质是讨论谱峰间的距离和谱峰的宽窄，即所谓色谱柱的高效性和高选择性。这两个性能指标的理论本质，是由组分在两相中分配系数不同的热力学过程和组分在两相中扩散速度不同的动力学过程所决定的。因此，要达到多组分复杂混合物通过色谱柱理想地分离，就必须从热力学和动力学两个方面进行综合性地研究；同时对难分离物质要选择最佳色谱分离条件，以达到快速分离的目的。1、色谱方法的分类•随着色谱理论的不断完善和色谱技术的进步，其分类方法众多，常见的如下：用气体作为流动相气相色谱法Gaschromatography(GC)液相色谱法Liquidchromatography(LC)用液体作为流动相A、按两相状态分类：以流动相状态为准划分方法类型等十余种方法。B、按样品组分在两相间分离机理分类:利用组分在流动相和固定相之间的分离原理不同而命名的分类方法。吸附色谱法分配色谱法离子交换色谱法凝胶渗透色谱法离子色谱法超临界流体色谱法•••2、色谱技术问题•色谱技术有如下几方面：1.进样技术，特别是关于毛细管色谱的进样技术；2.色谱柱制备技术；3.固定相和流动相的选择技术；4.多维色谱系统组合切换技术；5.流出组分检测技术；6.程序升温技术和剃度洗脱技术等。这些技术都在实践中得到了广泛应用和继续提高，是色谱工作的一个重要方面。3、色谱仪器•色谱仪器是验证色谱理论和色谱技术应用的重要手段，也是建立各种分析方法的必须条件。上世纪90年代以来，色谱仪器的多样化、高精化、智能化等程度日新月异。著名的色谱仪器厂家有：美国的安捷伦公司、日本的岛津公司、waters公司等，国内的上海、大连等公司也生产了质量较高的色谱仪。4、色谱法的应用•由于色谱法独具特点，使它在各领域中获得广泛的应用。石油化学环境科学和环境保护生物学、微生物化学、生命科学食品工业、农林牧渔业医学及医药学商品检验•••应用领域二、色谱法的本质及流程1、色谱法的本质–色谱法的本质在于色谱柱高选择性和高效能的分离作用与高检测技术的结合。混合组分的样品在色谱柱中分离的依据是：同一时刻进入色谱柱中的各组分，由于在流动相和固定相之间溶解、吸附、渗透或离子交换等作用的不同，随流动相在色谱柱中运行时，在两相间进行反复多次（103～106）地分配过程，使得原来分配系数具有微小差别的各组分，产生了保留能力明显差异的效果，进而各组分在色谱柱中的移动速度就不同，经过一定长度的色谱柱后，彼此分离开来，最后按顺序流出色谱柱而进入信号检测器，在色谱数据机上显示出各组分的色谱行为和谱峰数值。2、色谱方法的装置系统流程–色谱方法装置流程图见下图5-记录仪二、色谱法的本质及流程1-流动相及控制装置；2-流动相净化器3-色谱柱4-检测器三、色谱分析法的一般特点1、高选择性•色谱分析方法对那些性质极为相似的物质，如同位素、同系物和烃类异构体等有良好的分离效果。这种选择分离，主要采用高选择性固定液，使各组分间的分配系数能产生较大的差别而实现保留值不同。2、高效能色谱分析法对那些沸点极为相近的多组分混合物和极其复杂的多组分混合物，有能力改善它们的峰形，使各组分彼此间有良好的分离效能。这种高效能作用,主要是通过色谱柱具有足够的理论塔板数（填充柱为几千块/m，毛细管柱可达105～106块/m）来实现的。3、高灵敏性色谱分析法的高灵敏度检测信号，表现在检测器方面。目前在色谱界已出现几十种检测器，可检测出10－11～10－13g的物质量。因此在痕量分析中可大显功效。如超纯气体、高纯试剂中的ppm→ppb级的痕量杂质测定，测定大气污染物中的ppb→ppt级的痕量毒物；测定农、副产品、水果、食品中的ppm→ppb级的农药残留物。4、分析速度快色谱分析法，特别是气相色谱法，分析速度较快。一般较为复杂的样品可在几分钟到几十分钟内完成。而且现在的色谱仪器多数已实现自动化、计算机化，配以高速分离的色谱系统，分析速度会更快。5、GC与LC特点之比较两种色谱法的根本区别在于流动相状态。气相色谱法多由永久性气体作流动相，由于载气相对分子质量低，分子间空隙大，故粘度低，流动性好，组分在气相中运输速度快，流动相渗透性强，因此可以增加柱长，提高色谱柱理论塔板数，从而增加柱效；气体作流动相价格较液体的有机溶剂低廉；气相色谱法可以选择愈来愈多的合成新固定液；气相色谱法分析的对象多为相对分子质量M1000、低沸点、易挥发、热稳定性较好的化合物，而且，样品必须在柱前变成气态分子，否则不能随载气运输分离。对于大分子、难挥发、热稳定性差的化合物较为困难。裂解气相色谱法可以对高分子化合物进行裂解后分离分析。液相色谱法采用液体作流动相。适于作液相色谱的流动相较仅有几种惰性气体的GC流动相多；流动相对样品组分有较好的溶解作用，且参与溶质的分配，可增大分离的选择性。液相色谱适于分析高沸点、难挥发、热稳定性差的、分子量（M＝1000～2000）较大的液体化合物，样品可直接进样，一般不需作样品衍生化处理。选择好流动相是改善液相色谱分离的关键之一（液体种类繁多，选用二元或三元流动相时同时洗脱，改变载液的种类浓度、比例、极性、pH稳定等，则可以提高LC的分离度）；流动相因为是液体，所以密度较高，组分扩散系数（DL）低（大约占气体的10－5），故LC分析速度慢；液体粘度大于气体100多倍，传质也较慢，故采用小颗粒，窄分布固定相和高压泵强制流动相通过色谱柱以获得高效率分离；高效液相色谱有其独特的检测器，如紫外检测器、示差检测器、荧关检测器等，它们都有高的灵敏度；高效液相色谱可进行大组分量制备，收集柱流出组分十分方便。四、色谱基本理论1、色谱图•色谱图是色谱柱流出物通过检测器系统时所产生的响应信号对时间或载气流出体积的曲线图。色谱图是色谱基本参数的源流，可根据色谱图中峰位置点进行定性，根据峰高或峰面积进行定量；根据各峰不同的位置及其峰宽变化状态，可对色谱柱的分离性能进行评价，表征色谱操作条件的优劣。2、色谱图相关名词•（色谱）峰（Chromatographic）Peak色谱柱流出组分通过检测器系统时所产生的响应信号的微分曲线。•峰底Peakbase峰的起点与终点之间连接的直线（见图3中的CD）。•峰高（h）PeakHeight从峰最大值到峰底的距离（见图3中的BE）。•峰宽（W）PeakWidth在峰两侧拐点处作切线与峰底相交两点之间的距离（见图3中的KL）。色谱流出曲线图•半高峰宽（Wh/2）PeakWidthathalfheight通过峰高的中点作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交两点之间的距离（见图3中的HJ）。•峰面积（A）Peakarea峰与峰底之间的面积（见图3中的CHEJDC）。•标准偏差（ɑ）Standarderror0.607倍峰高处所对应峰宽之一半。•拖尾峰TailingPeak后沿较前沿平缓的不对称的峰。•前伸峰leadingPeak前沿较后沿平缓的不对称的峰。•假峰GhostPaek并非由试样所产生的峰。•畸形峰DistortedPeak形状不对称的峰，如拖尾峰、前伸峰。•基线Baseline在正常操作条件下，仅有载气通过检测器系统时所产生的响应信号的曲线。•基线漂移Baselinedrift基线随时间定向的缓慢变化。•基线噪声（N）Baselinenoise由各种因素所引起的基线波动。三、色谱基本参数1、死时间（tM）Deadtime•不被固定相滞留的组分，从进样到出峰最大值所需的时间（见图3中的tM）。2、保留时间（tR）Retentiontime•组分从进样到出现峰最大值所需的时间（见图3中的tR）•调整保留时间（t’R）Adjustedretentiontime•减去死时间的保留时间（见图3中的t‘R）t’R＝tR—.tM3、死体积（VM）DeadVolume•不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的载气体积。4、保留体积（VR）RetentionVolume•组分从进样到出现峰最大值所需的载气体积。VR=tR.FCFC－载气流速（ml/min）。5、柱效能Columeefficiency色谱柱在色谱分离过程中主要由动力学因素（操作参数）所决定的分离效能。通常用理论板高或有效板数表示。①、理论板数（n）Numberoftheoreticalplate•表示柱效能的物理量，可由下式计算•n=5.54(tR/W)2=16()2②、理论板高（H）Heightequivalenttoatheoreticalplate•单位理论板的长度。H=L/n③有效板数（neff）Numberofeffectiveplate•减去死时间后表示柱效能的物理量，可由下式计算：•neff＝5.54()2=16()2色谱的定性分析一般定性1、用已知物直接对照法定性–利用已知物直接对照法定性，是一种简单可靠的定性方法，在具有已知标准物情况下常使用这种定性方法。该方法定性的依据是：在一定的柱条件（柱长、固定相）操作条件下，组分有固定的保留值。因此，控制条件一定，比较已知物和未知物的保留值，就可方便地确定某一色谱峰是什么物质。A、利用保留时间和保留体积定性–利用保留时间tR定性是最简单地一种定性方法。只要准确测量未知物和标准物地保留时间进行比较，相同者为同一物质。利用保留时间定性，缺点是tR受操作条件影响大，载气流速微小的波动、稳定微小的变化都会使tR改变，从而给定性带来困难。用保留体积VR定性，不受载气流速的影响，操作也很方便。B、用相对保留值定性•利用保留时间或保留体积定性受条件影响大。保留体积虽不受流速影响，仍受其它操作条件影响。而相对保留值仅受柱温、固定相性质影响，柱长、填充情况、流速等均不影响ris值。因此在柱温、固定相一定时，ris为定值，可作为定性的较为可靠的参数。C、用已知物增加峰高法定性•如果样品组成复杂，峰间距小，这时要准确定出保留值有一定困难，峰高增加法是在此条件下最可靠的定性方法。具体方法是：先进一样品，得一谱图，然后在样品中加入一定量的标准物质，同样条件下进一针标样品，从新得到的谱图上看，哪个峰高了，那么，该峰就是加入的标准物组分。2、色谱定量分析色谱分析的重要作用之一是对样品定量。色谱法定量的依据是：组分的重量或在载气中的浓度与检测器的响应信号成正比。在此，响应信号指峰面积或峰高，表示为：wi=fiAi，其中wi为欲测组分I的量，Ai为组分I的峰面积，fi为比例系数，在此称为校正因子。因此，要准确定量，首先要准确测出峰面积与定量校正因子。定量校正因子是定量计算公式中的比例常数，其物理意义是单位峰面积所代表的被测组分的量。定量分析的依据是被测组分的量与响应信号成正比，但是，同一含量的不同物质，由于其物理、化学性质的差别，即使在同一检测器上产生的信号大小也不同，直接用响应信号定量，必然产生较大误差。因此提出了定量校正因子。定量校正因子对信号加以校正，校正后的峰面积可定量地代表物质的含量。A、面积的测量①对称峰面积的测量对称色谱峰近似地看作一个等腰三角形，按照三角形求面积的方法，峰面积为Ai＝hiW，经验证明该方法计算的面积只有实际面积的0.94倍，故再乘一系数1.065，Ai＝1.065hiW，这是目前应用较广的计算法。1、不对称峰面积的测量在色谱分析中，经常会遇到不对称峰，多数不对称峰为拖尾峰，峰面积的计算方法为：取峰高0.15倍处和0.85倍处峰宽平均值，乘峰高：A=(W0.15h+W0.85h)×h峰高在定量分析中的作用峰高也可作为定量指标，对于一定的样品，如果操作条件保持不变，在一定的进样量范围内，半高峰宽是不变的，峰高可直接代表组分的浓度，由峰高代替面积计算。方法快速、简便，适用于固定不变的常规分析。与使用面积定量法比较，对于出峰早的组分，由于半高峰宽很小，相对误差大，这时用峰高定量更准确。对于出峰晚、峰