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11.微生物代谢工程定义、研究内容和研究手段。（1）定义：代谢工程是利用重组DNA技术或其他技术,有目的地改变生物中已有的代谢网络和表达调控网络,以更好地理解细胞的代谢途径,并用于化学转化、能量转移及大分子装配过程。（2）研究内容：生物合成相关代谢调控和代谢网络理论；代谢流的定量分析；代谢网络的重新设计；中心代谢作用机理及相关代谢分析；（3）研究手段:代谢工程综合了基因工程、微生物学、生化工程等领域的最新成果。①基因操作技术：在代谢工程中，代谢网络的操作实质上可以归结为基因水平上的操作：涉及几乎所有的分子生物学和分子遗传学实验技术，如基因和基因簇的克隆、表达、调控，DNA的杂交检测与序列分析，外源DNA的转化，基因的体内同源重组与敲除，整合型重组DNA在细胞内的稳定维持等。②分析手段：组学技术(X-omics)：工业微生物基因组测序与功能基因组分析；基于基因芯片的转录组学分析；蛋白质组学技术；基于同位素技术的代谢通量组学。③检测技术：常规的化学和生物化学检测手段都可用于代谢工程的研究，如物料平衡、同位素标记示踪法、酶促反应动力学分析法、光谱学法、生物传感器技术。2.代谢改造思路和代谢设计原理。（1）代谢改造思路：代谢工程研究的重点在于改造代谢网络，以便生产特定目的代谢产物或具有过量生产能力的工程菌应用于工业生产。根据微生物的不同代谢特性，常采用改变代谢流、扩展代谢途径和构建新的代谢途径三种方法。a改变代谢途径的方法：加速限速反应，增加限速酶的表达量，来提高产物产率。改变分支代谢途径流向，提高代谢分支点某一分支代谢途径酶活力，使其在与其它的分支代谢途径的竞争中占据优势，从而提高目的代谢产物的产量。b扩展代谢途径的方法：在宿主菌中克隆和表达特定外源基因，从而延伸代谢途径，以生产新的代谢产物和提高产率。扩展代谢途径还可使宿主菌能够利用自身的酶或酶系消耗原来不消耗的底物。c转移或构建新的代谢途径：通过转移代谢途径、构建新的代谢途径等方法来实现。(2)代谢设计原理a.现存代谢途径中改变增加目的产物代谢流增加限速酶编码基因的拷贝数；强化以启动子为主的关键基因的表达系统可以提高产物的转化率；提高目标途径激活因子的合成速率；灭活目标途径抑制因子的编码基因；(5)阻断与目标途径相竟争的代谢途径；改变分支代谢途径流向；构建代谢旁路；改变能量代谢途径。b.在现存途径中改变物流的性质：利用酶对前体库分子结构的宽容性；通过修饰酶分子以拓展底物识别范围c.在现存途径基础了扩展代谢途径：在宿主菌中克隆、表达特定外源基因可以延伸代谢途径，从而生产新的代谢产物、提高产率。3.微生物的基因操作技术有哪些？（举两例说明）PCR技术，核酸的凝胶电泳，核酸的分子杂交技术，细菌的转化，DNA序列分析，基因的定点诱变，蛋白质及RNA相互作用技术，酶切及基因敲除技术等。大引物诱变法（1）基因的定点诱变：目前，主要采用两种PCR方法，即重叠延伸技术与大引物诱变法2在基因序列中进行定点突变。（2）核酸的分子杂交技术：具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针（probe）。Southern杂交，Northern杂交，原位杂交（ISH），荧光原位杂交（FISH）。（3）基因敲除：同源重组，cre/lox,FLP/FRT4.什么是酶的反馈抑制，以缬氨酸代谢途径来举例说明。（见第7题,1-（2））酶的反馈抑制是指最终产物抑制作用，即在合成过程中有生物合成途径的终点产物对该途径的酶的活性调节，所引起的抑制作用，包括顺序反馈抑制、同工酶的反馈抑制、协同反馈抑制、累积反馈抑制、增效反馈抑制。以缬氨酸为例：缬氨酸由丙酮酸合成，涉及四个反应，分别由四个酶催化，依次为乙酰羟酸合酶(AHAS)、乙酰羟酸同分异构酶(AHAIR)、二羟酸脱水酶(DHAD)和支链氨基酸转氨酶(TA)。首先，由AHAS将两分子丙酮酸缩合成2-乙酰乳酸；其次，AHAIR将2-乙酰乳酸转化为双羟基异戊酸；再次，由DHAD将双羟基异戊酸脱水形成2-酮异戊酸；最后，TA将2-酮异戊酸转化为L-缬氨酸。L-缬氨酸和L-异亮氨酸的合成共享AHAS、AHAIR、DHAD和TA等4种酶。如AHAS以丙酮酸为底物则合成L-缬氨酸，而用丙酮酸和2-酮丁酸为底物则合成L-异亮氨酸。缬氨酸合成反馈抑制的主要对象是其合成途径上的第一个关键酶乙酰羟酸合酶（AHAS），同时缬氨酸和异亮氨酸的合成酶系受三个末端产物缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的多价阻遏。因此，如果解除AHAS的反馈抑制和缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物酶系的阻遏，必将大大提高缬氨酸的积累。为此可选育缬氨酸结构类似物抗性突变株来解除缬氨酸的反馈调节。如抗缬氨酸突变株的获得，或者利用分子手段对关键酶基因进行定点突变。5.微生物酶的自动调节方式（举两例说明）。微生物并不是在所有空间、时间内合成它所能合成的全部酶，在一定生理条件下，微生物只合成它当时所需要的酶；存在于细胞内的酶活力是受到控制的，酶的催化过程必须3与细胞对能量和细胞组分的需求相协调。微生物酶的自动调节主要分为以下几个不同水平的调节（1）转录水平上的调节①酶的诱导的机制酶的诱导对于微生物是十分有意义的。从营养的角度看，微生物可以根据环境所提供的生长底物，诱导合成相应的酶(蛋白质)，以分解生长底物，吸收营养，进行代谢活动，从而加强微生物对环境的适应能力。②营养阻遏的机制在用混合碳源培养大肠杆菌的研究中发现，细胞只生成能降解培养基中能最迅速被同化的碳源的酶系，而用来降解其他碳源的酶系的合成在该碳源用完前一直受到阻遏。③终端产物对其自身合成途径的酶的合成的反馈阻遏和弱化的机制许多氨基酸生物合成途径不但受该氨基酸本身的调节而且受其对应的氨基酰tRNA的调节，前者指的是反馈阻遏，后者指的是叫做弱化的另一种类型的控制，阻遏控制转录的开始，弱化控制转录的终止。(2)翻译水平上的调节包括两层意思，其一是对翻译速度的调节；其二是对已译成的、会成为细胞的包袱的蛋白质分子的破坏性降解。(3)蛋白质水平上的调节①变构蛋白和变构酶的调节；②共价调节酶的调节：可由共价修饰引起酶活性或（和）调节特性改变的酶叫共价调节酶。共价调节酶可以在另外一个酶（修饰酶）的催化下被共价地修饰，即在它分子上共价地结合上或者释放一个低分子量基团，从而使酶的活性发生变化。举例：(1)酶的诱导调节机制：乳糖操纵子包括调节基因、启动子、操纵基因和结构基因。在含葡萄糖的培养基中大肠杆菌不能利用乳糖，只有改用乳糖时才能利用乳糖。操纵子的调控机理是：当在培养基中只有乳糖时由于乳糖是lac操纵子的诱导物，它可以结合在阻遏蛋白的变构位点上，使构象发生改变，破坏了阻遏蛋白与操纵基因的亲和力，不能与操纵基因结合，于是RNA聚合酶结合于启动子，并顺利地通过操纵基因，进行结构基因的转录，产生大量分解乳糖的酶。（2）酶的阻遏调节机制：色氨酸操纵子的调节：当培养基中色氨酸含量较高时，色氨酸与游离的辅阻遏蛋白相结合，并使其与操纵区DNA紧密结合；当培养基中色氨酸供应不足时，辅阻遏物失去色氨酸并从操纵区上解离，trp操纵子失去阻遏。6.微生物基因水平的调控策略，请举例说明（1）操纵子正调控：阻遏蛋白从操纵基因上脱离后，激活蛋白与启动子结合以及和RNA聚合酶的相互作用，帮助结构基因的转录起始，促进相应蛋白的合成。乳糖操纵子负调控：阻遏蛋白与操纵基因的结合，阻止了RNA聚合酶对操纵子结构基因的转录。色氨酸操纵子。（2）转录终止调控：衰减作用：原核生物中通过翻译前导肽而实现控制DNA的转录的调控方式。前导序列(leadersequence)：位于翻译起始密码子AUG之前的一段不参与翻译的mRNA5’端的核苷酸片段Trp操纵子衰减作用，发卡结构47.如何采用代谢工程进行缬氨酸育种？51谷氨酸棒状杆菌生物合成L-缬氨酸的途径和调控机制L-缬氨酸在谷氨酸棒状杆菌中的生物合成途径。葡萄糖经过糖酵途径生成L-缬氨酸合成的重要前体丙酮酸(pyruvate)，再通过4步反应合成L-缬氨酸：首先ilvBN基因编码的乙酰羟酸合成酶(acetohydroxyacidsynthase,AHAS)将两分子的丙酮酸缩合成2-乙酰乳酸(2-acetolatate)，然后在ilvC基因编码的乙酰羟酸还原异构酶(acetohydroxyacidisomeroreductase,AHAIR)催化下转化为双羟基异戊酸(2,3-dihydroxyisovalerate)，再由ilvD基因编码的二羟酸脱水酶(dihydroxyaciddehydratase,DHAD)将双羟基异戊酸脱水形成2-酮异戊酸(2-ketoisovalerate)，最后ilvE基因编码的转氨酶B(transaminaseB,TA)将2-酮异戊酸转化成L-缬氨酸。胞内积累的L-缬氨酸由brnFE编码的转运蛋白复合体BrnFE转运至胞外。在C.glutamicum中，一些其它代谢产物的合成途径与L-缬氨酸的合成途径相互交错。L-缬氨酸合成途径的4个关键酶也用于L-异亮氨酸(L-isoleucine)合成：先由丙酮酸和苏氨酸(threonine)经ilvA基因编码的苏氨酸脱水酶(threominedehydratase,TD)催化反应生成2-酮丁酸(2-ketobutyrate)，再共用这4种酶催化4步反应生成L-异亮氨酸。丙酮酸还是多种反应的前体，包括由丙酮酸脱氢酶复合体(pyruvatedehydrogenasecomplex,PDHC,其中关键酶Elp由aceE基因编码)催化反应生成乙酰辅酶A(acetyl-CoA)；由pqo基因编码的丙酮酸：醌氧化还原酶(pyruvatequinineoxidoreductase,PQO)催化反应生成乙酸(acetate)；由pyc基因编码的丙酮酸羧化酶(pyruvatecarboxylase,PC)催化反应生成草酰乙酸(Oxaloacetate)；由ldh基因编码的乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)催化反应生成乳酸(lactate)，以及由alaT和avtA基因编码的丙氨酸转氨酶(alanineaminotransferase,AA)催化反应生成L-丙氨酸(L-alanine)等。L-缬氨酸合成途径的中间产物2-酮异戊酸可以由panB基因编码的羟甲基转移酶(hydroxymethyltransferase,HT)催化起始，经3步反应生成D-泛酸(D-pantothenate)；还可以由leuA基因编码的异丙基苹果酸合酶(isopropylmalatesynthase,IS)催化起始，经4步反应生成L-亮氨酸(L-leucine)。对谷氨酸棒状杆菌生物合成L-缬氨酸进行代谢改造，还需要明确其代谢途径的调控机制。目前已知的调控主要有：AHAS对底物的亲和性，产物对AHAS的反馈抑制，ilvBNC的转录弱化，PdxR和AvtA对TA的调控，以及全局调控因子Lrp对BrnFE的调控(图1-1)。(1)AHAS对底物的亲和性谷氨酸棒状杆菌AHAS催化反应底物包括对2-酮丁酸和丙酮酸，但对前者的亲和性较高，会优先合成L-异亮氨酸，不利于L-缬氨酸的积累。因此要考虑减弱其他相关代谢产物的合成，将代谢碳流导向L-缬氨酸的合成。(2)产物对AHAS的反馈抑制谷氨酸棒状杆菌AHAS是一个四聚体，包括ilvB基因编码的两个大亚基(催化亚基)和ilvN基因编码的2个小亚基(调节亚基)，ilvBN与ilvC基因一起，构成一个操纵元ilvBNC。AHAS的调节亚基可以受3种支链氨基酸(缬氨酸､亮氨酸､异亮氨酸)中任何一种的反馈抑制，其中缬氨酸的抑制能力最强；在单一支链氨基酸或者多种协同作用下，被抑制程度不超过57%。这表明3种BCAAs与C.glutamicum的AHAS调节亚基结合位点可能相同，只是亲和性有差异。L-缬氨酸的积累需要减弱或者消除这种反馈抑制。(3)ilvBNC的转录弱化谷氨酸棒状杆菌ilvBNC操纵元有典型的转录弱化特征：ilvB基因上游