CRISPR-CAS9蛋白说明书-B

CRISPRCas9蛋白说明书品名：CRISPRCas9蛋白货号：PC1400厂家：北京英茂盛业生物科技有限公司电话：[phone]产品简介：Cas9蛋白是原核表达纯化的蛋白产品，蛋白大小160kD。具有体外结合sgRNA并切割双链DNA的功能。产品配套提供Cas9反应缓冲液，阳性对照sgRNA，阳性对照DNA。本产品主要用于CRISPR/Cas9系统体外酶切实验、CRISPR靶点筛选等实验。产品规格：货号PC1400-0PC1400-1PC1400-5Cas9蛋白100U100U500U10×Cas9Buffer150ul150ul600ul阳性对照sgRNA（0.1ug/ul）-10ul30ul阳性对照DNA（0.2ug/ul）-25ul75ulRNasefreeH2O-1ml5ml3MNaAcpH5.2-150ul600ul活性定义：37℃，30分钟切割1ug1kBDNA双链定义为1个活性单位。储存条件：-20℃冻存使用方法：使用前必读注意事项：1、需要自备的试剂及耗材：酚氯仿异戊醇试剂；无水乙醇；70%乙醇；无RNA酶枪头、离心管。2、务必使用无RNA酶的枪头、离心管配制Cas9反应体系。3、推荐按照表中的顺序加入反应成分。加入sgRNA后吹吸数次混匀，再加入其它反应成分。4、Cas9蛋白会与DNA形成复合物，影响电泳。反应液需要纯化后才能用于电泳。实验步骤：1、Cas9切割反应：按照下表配制Cas9体外切割反应缓冲液：Cas9蛋白5UsgRNA0.2ug底物DNA1ug10×Cas9Buffer5ulRNasefreeH2Oto50ul阳性对照反应：Cas9蛋白5ul阳性对照sgRNA2ul阳性对照DNA5ul10×Cas9Buffer5ulRNasefreeH2Oto50ul37℃反应30~60分钟。2、反应产物纯化：本步骤及以后的步骤不必使用无RNA酶耗材操作1)在50ul反应产物中加入5ul3MNaAcpH5.2，混匀。2)加入50ul酚氯仿异戊醇试剂。震荡混匀。3)室温12000rpm离心5min。4)取上清至新的1.5ml离心管，加入100ul无水乙醇，混匀。5)4℃12000rpm离心10min。6)去除上清，加入500ul70%乙醇，震荡混匀。7)4℃12000rpm离心5min。8)去除上清，用移液器尽量吸去残留液体，开口室温放置2-5min。9)加入10-15ul蒸馏水，震荡溶解沉淀。10)取3-5ul进行凝胶电泳检测。阳性对照：阳性对照DNA为760bp双链DNA。含有单一靶点。经过切割后形成310bp和450bp两条链。M1234阳性对照切割电泳图。M：DL2000DNAmarker4：Cas9蛋白加gRNA切割0min3：Cas9蛋白加gRNA切割10min2：Cas9蛋白加gRNA切割30min1：Cas9蛋白不加gRNA切割30min其它说明：1、体外转录的sgRNA大小为100bp。在使用前无需去除转录模板DNA。RNA聚合酶及其他体外转录成分的存在对Cas9蛋白切割效果没有明显影响。但是为了准确定量RNA，最好采用酚氯仿抽提乙醇沉淀纯化RNA。2、在将sgRNA用于Cas9蛋白切割实验前，需要sgRNA的完整性。推荐用2%琼脂糖凝胶电泳检测。RNA条带应该为单一清晰的条带，无弥散。3、不是所有设计的CRISPR靶点都能被高效识别和切割，可以对同一段DNA靶序列设计2-3个靶点，同时进行体外切割实验。4、切割底物为双链DNA，可以是质粒或者PCR产物。纯化方式可以为纯化柱或者乙醇沉淀。5、质粒切割时最好同时做阴性对照。产品保存注意事项：1、Cas9蛋白在需冰上融化后使用。注意使用过程中尽量保存在冰上。2、阳性对照sgRNA需用无RNA酶枪头取用，以免RNase污染导致降解。