pcr的发展历程

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PCR的发展历程PCR技术的基本原理PCR:聚合酶链式反应。1983年由美国科学家KARYMULLIS提出,1993年因此而获诺贝尔奖。PCR技术是指通过模拟体内DNA复制的方式,在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术,它包括变性、退火、延伸三个步骤。①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。标准的PCR反应体系:10×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物各10~100pmol模板DNA0.1~2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至100ulPCR反应五要素:引物、酶、dNTP、模板和Mg2+PCR的发展史1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。1988年初,Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR,其扩增的DNA片段很均一,真实性也较高,只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次,仍需加入新酶。1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶,此酶的发现使PCR广泛的被应用。第一代:手动/机械手式水浴基因扩增用三个恒温水浴箱,分别将三个水浴温度恒定在三个温度:PCR的高温变性温度(如94℃)低温复性温度(如58℃),适温延伸温度(如72℃)。再用一个装有PCR标本试管的提篮,用手工在不同温度的水浴箱中依次水浴。这种方法的特点是:实验人员劳动强度大,容易因疲劳引起差错;而优点是:设备简单,投资少,与自动化基因扩增仪相比,它无须升降温过程,实验时间短,试验更接近理想PCR反应条件。第二代:自动化控制型PCR特点:使用广泛及具有代表性,采用琼脂糖电泳的方式对PCR产物进行分析,但存在着操作繁琐、只适用于定性研究、交叉污染风险大等不足。第三代PCR:实时荧光定量PCR为了避免上述传统PCR的缺陷,并对基因的表达水平进行定量分析,1992年诞生了所谓“第三代PCR的荧光定量实时PCR。所谓real-timeQ-PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基因,利用荧、光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定、量分析的方法。·数字PCR由于定量PCR的分析最终结果依赖于Cq值,在这个意义上所谓的“定量”也只是相对的。而且在低拷贝靶分子、模板浓度差异细微的条件下,其检测的灵敏度、精确度都受到了限制。在这种背景下,“数字PCR应运而生。数字PCR是一种核酸分子绝对定量技术。相较于实时荧光定量PCR,数字PCR可让你能够直接数出DNA分子的个数,是对起始样品的绝对定量。因此特别适用于依靠Ct值不能很好分辨的应用领域:拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究(如等位基因不平衡表达)、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。谢谢!

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