病原生物学实验课件.

病原生物学实验课件病原生物教研室制作实验一1、实验目的和要求2、实验室规则3、消毒与灭菌4、介绍常用灭菌器材5、常用仪器的使用6、油浸镜的原理、使用、保护7、紫外线杀菌试验8、自然界细菌的分布9、细菌的培养10、细菌的生化反应实验目的和要求一、实验目的(1)掌握病原生物学的基本实验方法和操作技术。(2)通过实验设计的讨论和结果分析，培养学生的科学思维方法，提高其独立工作的能力。二、实验要求(1)每次实验前，必须做好预习，明确实验目的、原理、方法及操作中的注意事项等，避免和减少错误操作。(2)实验过程中，必须持严肃认真的态度。(3)对实验现象和结果必须进行仔细的观察和认真的记录，然后进行科学分析，得出恰当的结论。(4)实验报告要独立认真地完成，书写实验报告要字迹清楚、语言简练、表格清晰，画图应力求反映实际标本的原状。(5)切实遵守实验室规则。实验室规则(1)上实验课时，先到更衣室把个人的书包和衣物放到衣柜内，穿好实验服。随身只许携带必须的教材、笔记本、文具等，但要置于远离操作部位的位置。(2)实验室要保持正常的工作秩序，不得高声谈笑和走动。(3)实验室内禁止饮食和吸烟，不得用嘴舔湿铅笔或标签等。(4)实验用过的带有传染性物质的吸管、玻片等应放在指定的消毒筒内，待消毒或废弃的物品必须放在指定地点。(5)如发现有传染性的材料污染地面、桌面、书和衣物等时，应立即报告老师，以便及时处置。(6)如将活菌碰到手上，应将手浸入来苏水中5-10min，然后用自来水冲洗；如将痰液吸人口内，应立即吐出，再用质量分数为0．1％的高锰酸钾漱口，必要时服用有关药物。(7)注意节约实验试剂，爱护实验器材。器材损坏时，应立即报告老师，听候处理。(8)易燃物品(酒精、二甲苯等)不准接近火源。一旦起火，应立即用沾水的布或沙土覆盖扑火。(9)实验结束后，将实验台整理好，值日同学打扫室内卫生，并检查水、电等开关是否关好，防止发生事故。(10)实验结束后，到更衣室脱下实验服，将实验服放人衣柜内，洗手消毒后离去。消毒与灭菌原理：微生物由蛋白质、核酸、脂类等构成，极易受外界条件的影响，对多种物理、化学因素都敏感。消毒与灭菌就是根据这一原理抑制或杀死外环境中的病原微生物。消毒(disinfetion)杀死物体上病原微生物的方法，并不一定能杀死含芽胞的细菌和非病原微生物。用以消毒的药品称为消毒剂(disinfectant)。一般消毒剂在常用的浓度下，只对细菌的繁殖体有效，对其芽胞则需要提高消毒剂的浓度和延长作用的时间。灭菌(sterilization)杀灭物体上所有微生物的方法。因此，灭菌比消毒要求高，包括杀灭病原微生物和防腐(antisepsis)防止或抑制细菌生长繁殖的方法，细菌一般不死亡。同一种化学药品在高浓度时为消无菌(asepsis)不含活菌的意思。防止细菌进入人体或其它物品的操作技术，称为无菌操作。一、物理消毒灭菌法（一）热力灭菌法1.干热灭菌法：火焰灼烧灭菌和热空气灭菌。原理加热使蛋白质变性，与水的含量有关，当环境和细胞含水量越大，凝固越快。（1）焚烧：被污染的纸张、实验室有传染性的动物尸体、无经济价值的物品可以烧掉。（2）烧灼：火焰灼烧适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，试管口和瓶口，涂布用玻璃棒。（3）干烤：干烤灭菌法需在干烤箱进行，靠热空气进行灭菌。这种方法适用于玻璃器皿、金属器械以及不能遇水的油脂、凡士林等灭菌。灭菌时一般加热至160～170℃2小时可达到灭菌的目的。在装满物品的干烤箱内，不同部位的温度差可达30～40℃，故温箱内最好装有鼓风机使温度均匀。箱内物品不宜装得太多，以免影响空气的流通。（4）红外线：红外线烤箱，供小件器械(镊子、剪刀等)以及玻璃注射器等迅速灭菌用。注意事项：1）培养基、橡胶制品、塑料制品不能用此法；2）温度控制在180°；3）物品不能太挤；4）温度降至70°时才开箱门。2.湿热灭菌法:原理：因为湿热中菌体吸水，蛋白质容易凝固。蛋白质凝固时所需温度与其含水量成反比关系，即蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿热的蒸气有潜热存在。湿热的穿透力比干热大。试验证明将100层的布卷，如用130～140℃干热，加热4小时，布卷第20层的温度只有86℃，第100层的温度不到70℃，而用105℃的湿热，加热3小时布卷第20层到100层的温度都是101℃。所以效果比同温度下干热好。（1）巴氏消毒法(pasteurization)：常用于牛奶和酒类等物品的消毒。具体的消毒方法有两种：一是以61.1～62.8℃消毒30分钟；另一方法是以71.7℃，消毒15～30秒钟。(2)煮沸消毒法：煮沸5分钟，可杀灭所有的细菌繁殖体。但杀死芽胞则需一至数小时。如在水中加入1%碳酸钠即可提高沸点，增强杀灭芽胞作用，同时又可防止金属器械生锈。如水中加2～5%石炭酸，则10～15分钟后可破坏芽胞，所以许多医疗器械如手术刀、剪、镊子、胶管、注射器等，常用煮沸消毒。(3)流通蒸气消毒法：用阿诺氏灭菌器或普通蒸气笼进行。因此在正常大气压下，故温度不会超过100℃。普通细菌的繁殖体15～30分钟可杀死。但芽胞不易消灭。(4)间歇灭菌法：有些物质不能加热至100℃以上，例如含血清的培养基等，为了消灭其中的细菌芽胞，须用间歇灭菌法。方法是用阿诺灭菌器或用蒸笼加热100℃维持30分钟，每天进行一次，连续三天。第一次加热后，细菌的繁殖体即被杀灭，而芽胞还能存活，为了使芽胞发芽成繁殖体，将被灭菌的物品取出放在室温37℃温箱内过夜，第二天再加热一次，则可杀死由芽胞生成的繁殖体。为了达到彻底灭菌，照上法再进行第三次加热，这样所有的芽胞将被杀灭。应用间歇灭(5)高压蒸气灭菌法设备：高压灭菌锅时间长短根据灭菌物品的种类和数量不同有所变化。适用于培养基等的灭菌，在1.05kg/cm2蒸气压下，温度达121.3℃，维持15～20分钟，可杀灭包括细菌芽胞在内的所有微生物。高压蒸气灭菌器就是根据这一原理制成的，常用于一般培养基、生理盐水、手术敷料、工作服、橡胶物品等耐高温、耐湿热等物品的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。杀灭几类主要微生物的湿热条件微生物营养细胞孢子或芽孢酵母菌50-60℃，5分钟70-80℃，5分钟霉菌62℃，30分钟80℃，30分钟细菌（中温细菌）50-70℃，10分钟2-800分钟，100℃；或120℃，05-12分病毒60℃，30分钟(二)电磁波辐射杀菌法1.紫外线：原理：紫外线波长在200－300nm，具有杀菌作用，以265-266杀菌力强。此段波长易被细胞中核酸吸收；这与DNA的吸收光谱范围一致。紫外线主要作用于DNA，使一条DNA链上相邻的二个胸腺嘧啶共价结合而形成双聚体，因而改变DNA的分子构型，干扰DNA的复制与转录，导致细菌的死亡或变异。可产生臭氧和过氧化氢。杀菌效力与强度和时间的乘积成正比。缺点：穿透力不大。距照射物1.2m为宜。紫外线释放的能量较低，故穿透力较弱，普通玻璃、纸张、尘埃、水蒸气等均能阻挡紫外线。应用：只能用于手术室、传染病房、细菌实验室的空气消毒，或用于不耐热物品的表面消毒。注意事项：杀菌波长的紫外线对人体皮肤、眼睛有损伤作用，使用时应注意防护。2.电离辐射：包括高速电子、X射线和γ射线等。在足够剂量时，对各种细菌均有致死作用。其机制在于产生游离基，破坏DNA。电离辐射常用于大量一次性医用塑料制品的消毒，亦可用于食品的消毒，而不破坏其营养成分。(三)滤过除菌法：是用物理阻留的方法将液体或空气中的细菌除去。所用的器具是滤菌器(filter)。滤菌器含有微细小孔，只允许液体或气体通过，而大于其孔经的细菌等颗粒不能通过。滤过除菌主要用于一些不耐高温灭菌的血清、毒素、抗生素，以及空气等的除菌。目前过滤除菌采用两类器具，一类叫深层滤器，例如用烧结玻璃、不上釉的陶瓷颗粒或石棉压成的滤板等：另一类是滤膜。深层滤器已经使用了100年以上，现在有逐渐被滤膜取代的趋势，但因为大量沉淀物容易堵塞滤膜，所以一般先用深层滤器除去大的颗粒。滤膜一般由醋酸纤维素、硝酸纤维素、多聚碳酸酯、聚偏氟乙烯等合成纤维材料制成。滤膜的孔径一般为0.2微米，它可以滤除绝大多数微生物的营养细胞。过滤法的最大缺点是不能滤除病毒。注意事项：1、压力适当；2、无菌条件下进行；3、防止渗透现象。我们来看一下滤膜灭菌是如何工作的。如左图所示，在一个漏斗形容器上部放置数片滤膜。右图是整个过滤系统。待除菌的液体装在三角瓶中（1），用蠕动泵（2）将液体抽到过滤器（3）内，滤过的液体进入事先灭菌的瓶子中。如果是灭菌少量液体，可以采用一种简单的的滤器。过滤法用途广泛，除在饮料、药物生产中使用外，空气也常常用过滤法除菌。我们通常做微生物学实验时灭过菌的容器一般用棉花塞堵在出口处，实际上就是过滤除去空气中的微生物，使进入容器的空气中没有微生物污染。微生物学实验室使用的超净台也是用过滤法除菌。(四)超声波杀菌(五)干燥与低温：干燥能引起细菌蛋白质的变性和盐类的浓缩，妨碍细菌的生长或导致死亡。细菌的种类对干燥的抵抗力差异很大。浓缩的盐溶液或糖溶液可使细菌脱水而停止生命活动，根据这些原理，干燥方法可保存食品。低温可以杀死细菌，特别是反复冻融时更易破坏细菌细胞的生命。这是由于冰冻过程中细菌胞内水分被胞外冰冻结晶吸收造成电解质浓缩和菌体蛋白变性，胞壁受损使胞内有机物(包括核酸、肽类等)随之漏出，致使细菌死亡。实际工作中低温（4～8℃）应用于保存菌种或标本。目前保存菌种较好的方法是真空冷冻干燥法。将细菌迅速冷冻干燥可维持生命数年之久，而不致改变其毒力及抗原性。此方法可保存菌种、毒种和生物制品。原理：应用化学制剂破坏细菌代谢机能。杀菌剂如重金属离子；抑菌剂如磺胺类及多数抗生素。注意：与药品的浓度高低，时间长短，微生物种类以及微生物所处的环境有关。常用化学杀菌剂有：乙醇、醋酸、石碳酸、福尔马林、升汞、高锰酸钾、新洁尔灭等二、化学消毒灭菌法常用消毒剂种类类别作用机制常用种类酚类蛋白变性，细胞膜损伤石炭酸醇类蛋白变性乙醇氧化剂氧化、蛋白沉淀高锰酸甲重金属盐氧化、蛋白酶变性红汞、硫柳汞氧化剂氧化、蛋白沉淀过氧乙酸、碘酒表面活性剂蛋白变性，细胞膜损伤新洁而灭染料干扰氧化、抑制繁殖龙胆紫1.酚类（1）石炭酸：2%～5%，用于器械、排泄物消毒。（2）来苏儿3%～5%，用于器械、排泄物、家俱、地面消毒；1%～2%用于手、皮肤消毒。（3）洗必泰：0.01%～0.05%，用于术前洗手，阴道冲洗等。2.醇类酒精：70%～75%，用于皮肤、体温计消毒，不适用于伤口、粘膜。3.氧化剂（1）高锰酸钾：0.1%，用于皮肤粘膜、水果、蔬菜、餐具等消毒。（2）过氧化氢：3%，用于皮肤创伤、化脓性炎症、厌氧菌感染消毒。（3）过氧乙酸：0.2%～0.5%，用于塑料、玻璃、人造纤维消毒，皮肤消毒(洗手)。各种消毒剂的应用（4）碘伏：2%～5%，用于皮肤消毒。（5）氯：0.2～0.5ppm（6）漂白粉：10%～20%，用于排泄物、地面、厕所消毒，饮水消毒。4.重金属盐类（1）硝酸银：1%，用于新生儿滴眼，预防淋球菌感染。（2）红汞：2%，用于皮肤、粘膜和小创伤消毒5.表面活性剂（1）新洁尔灭：0.1%，用于手术器械消毒、外科手术洗手；0.01%～0.05%用于粘膜及深部伤口感染消毒。（2）消毒净：0.1%，用于手术器械消毒、外科手术洗手。6.烷化剂甲醛：10%，用于浸泡、物品表面消毒、蒸气消毒。7.染料及酸碱类。影响消毒作用的因素1.2.3.4.温度5.pH值介绍常用灭菌器材1、手提式高压蒸汽灭菌器凡耐高温的普通培养基、药品、手术器械、外科敷料等，均可用此法灭菌。为保证灭菌效果和安全，器内要加入足量的水，装入的物品不要过挤，冷空气必须排尽，注意压力表的工作情况，防止压力表失灵而造成事故使用方法：(1)先将筒内注水，然后把要灭菌的物品装入内筒，再把盖拧紧，打开排气阀门，开始加热。(2)水沸腾后，排气阀门开始排出气体，待筒内气体全部排出后，关闭排气阀门。(3)筒内压力达到要