QX200-微滴式数字PCR

DropletDigitalPCRQX200™PCR微滴式数字系统始于微滴发现未知微滴式数字PCRddPCRTM是Bio-Rad独特的数字PCR技术ddPCR可对DNA或RNA分子采用绝对定量的方式进行分析具有无可比拟的精确性不再需要标准曲线ddPCR大大提升了数字PCR技术的可扩展性与实用性现在全新的QX200微滴式数字PCR系统已经面市与您一起探索未知以前所未有的角度发现新世界PCR技术通过对样品的随机分布以及后续的统计学分析而迈入数字化时代QX200系统采用先进的微流体技术每份样品可生成20000个高度均一的纳升级微滴并且还可通过反应孔合并对高达数以百万计的微滴进行分析实现单份样品更高的检测灵敏度使定量分析达到一个全新的水准凭借简便可靠的特点微滴式数字PCR已经在癌症分子标志物的发现传染病研究基因组结构变异分析基因表达分析等领域展现出了强大的优势但这仅仅是一个开始BioRad希望与您一起踏上微滴式数字PCR开启的发现之旅Bio-RadLaboratories,Inc.WHAT’SINADROPLET?■■■明了主要优势兼容TaqMan探针或EvaGreen无需标准曲线实现绝对定量分析实现超高灵敏度或高通量的样品分析快捷实验流程微滴式数字PCR的实验流程简单友好一次可处理8个样品实验流程扩展性好可在5个小时内完成96个样品的分析一天内更可运行多次实验满足高通量样品实验室的要求BioRadQX200ddPCR系统结合了油包水乳化微滴技术与微流体技术QX200系统由两部分组成微滴发生器和微滴分析仪微滴发生器可将每个样品生成20000均一的纳升级微滴目的片段和背景序列在微滴中随机分布每个微滴都是一个独立的反应器随后微滴被转移到96孔PCR板中在普通PCR仪上完成扩增PCR扩增后微滴分析仪对微滴逐个进行荧光检测相比于阴性微滴包含至少一个目标DNA或RNA分子的阳性微滴的荧光信号强度增加最后根据泊松分布通过阳性微滴的比例给出目标分子的绝对拷贝数QX200系统兼容TaqMan水解探针和EvaGreen检测此外灵活的设计使得用户既可通过合并反应孔实现超灵敏的核酸检测也可以通过一个反应孔运行一个样本实现高通量的样品检测Formoreinformation,visit™■■■■■■■■■■1234Workflow制备微滴将ddPCR反应混合液转入DG8微滴发生卡相应的孔内使用EvaGreen或水解探针进行PCR扩增将经过微滴化处理的样品转移到96孔PCR反应板中并封膜运行PCR程序读取并分析结果PCR结束后将PCR反应板置于QX200微滴分析仪内制备含有核酸样品的ddPCR反应液将核酸样品引物探针BioRadddPCR预混液混合均匀或经过验证的PrimerPCRddPCRassay每次运行可以生成8x20000个微滴目的片段和背景序列随机分布到微滴内微滴荧光信号的逐个检测分析使用QuantaSoftTM软件进行浓度copiesμl计算微滴发生卡Bio-RadLaboratories,Inc.2.Cancer/DNAMutationWHAT’SINADROPLET?癌症BioRadQX200ddPCR系统为癌症分子标志物定量分析提供了无与伦比的灵敏度突破了其他方法的局限性使用微滴式数字PCR技术研究人员现在能够实现对突变位点更细微的定量分析更好地明确其在癌症中的相关作用定量分子标志物实现肺癌相关的表皮生长因子受体EGFR中T790M突变的检测可以更好地评估抗酪氨酸激酶抑制剂的治疗然而由于其他技术检测灵敏度有限无法在高背景EGFR野生型中可靠地检测到T790M突变。目前已有研究人员使用ddPCR技术开发出精确性很高的检测方法以准确定量T790M的浓度成功案例在一份给定的样本中相比于野生型DNA癌症相关的突变序列比例较低经常无法检测凭借其超高灵敏度QX200系统可以很容易地定量分析低至1100000000001的突变频率之前用任何方法都无法实现准确稳定检测的样本现在可以使用微滴式数字PCR轻松进行定量分析Formoreinformation,visitµlFractionalabundance,%159016801880192018503.773.783.7673.675.372.41640000CancerBiomarkersBRAFV600E突变检测QX200系统的高灵敏度可以确保使用PrimePCRddPCRassays对野生型DNA背景下的BRAFV600E突变进行定量分析AQuantaSoft软件2D荧光强度图显示突变型野生型混合样本3个重复图上的黑色簇为阴性微滴绿色簇为野生型DNA阳性微滴蓝色簇为突变型DNA阳性微滴橙色簇为突变型和野生型DNA均为阳性的微滴B2D荧光强度图显示野生型样本3个重复C丰度分数图中显示为突变DNA在野生型背景DNA中的频率百分比橙色标记蓝色标记代表突变型DNA的浓度copiesμl3个重复绿色标记代表野生型DNA的浓度copiesμl3个重复QuantaSoft软件所生成的误差线表示95的置信区间Bio-RadLaboratories,Inc.GWHAT’SINADROPLET?病毒精确的病毒载量分析对于阐释疾病病程后续治疗及疗效评估是至关重要的病毒载量的波动即使只下降了非常低的水平意义却是显著的在对病原体的研究中能否实现准确而可靠的病毒DNA或RNA定量分析关系到实验的成败研究人员比较了qPCR和ddPCR方法检测临床样本中残留的人类免疫缺陷病毒HIV其中包括功能性治愈的HIV感染婴儿。研究人员发现在检测百万个细胞内的HIVDNA拷贝数时相比于qPCRddPCR的灵敏度提升了5倍在检测病毒长末端重复序列2-LTR环时ddPCR比qPCR灵敏20倍成功案例载量洞察QX200系统的高灵敏度可以确保从复杂样本中准确测定极其微量的病毒核酸分子除了精确性和可靠性QX200系统还可以为用户提供高通量的样本处理流程Formoreinformation,visitµlChannel2concentration,copies/µl10300103010301040103019609751030484240125ViralLoad单纯疱疹病毒和β2微球蛋白检测ddPCR可使用双重反应精确定量检测单纯疱疹病毒1型HSV1和ß2微球蛋白B2M且重复性极佳A2D荧光强度图显示样本中含有10000个拷贝孔HSV1和20000个拷贝孔的B2M3个重复黑色簇为阴性微滴绿色簇为HSV1阳性微滴蓝色簇为B2M阳性微滴橙色簇为两个HSV1和B2M均为阳性的微滴B浓度图显示在以20000拷贝B2M66ng人类基因组DNA作为背景的条件下HSV1浓度梯度从0到40000拷贝的样本浓度3个重复蓝色标记表示HSV1copiesμl绿色标记表示B2McopiesμlQuantaSoft软件所生成的误差线表示95的置信区间Bio-RadLaboratories,Inc.WHAT’SINADROPLET?基因组在人类基因组中拷贝数变异CNV是个体差异的一个重要来源CNV与癌症神经系统和自身免疫性疾病药物不良反应有密切的关系可靠地识别这类CNVs是开创性研究的一项重要手段研究人员研究一个参与人类大脑尺寸进化的高度重复基因亟需一种方法来验证待测样品中微小的CN变异实验证明微滴式数字PCR比之前使用的方法更有效更精确地检测到高CN状态下的微小差异且重复性极佳这些CNV定量分析的提升将有助于研究人员对神经源性疾病如微大头畸形精神分裂症和自闭症等进行更深入地研究变异区分成功案例拷贝数CN评估的主要技术瓶颈是如何在统计置信度下有效区分连续的CN从根本上说随着CN增加目标遗传物质之间的差异百分比下降这使得CNV的检测更加困难QX200系统通过在成千上万个微滴中进行CNV特定片段的扩增反应实现在卓越的统计置信度下对更高连续拷贝数例如5vs.6的区分Formoreinformation,visit骨髓细胞癌基因拷贝数及β珠蛋白检测QX200系统实现了拷贝数从CN1到CN13的卓越分辨率A2D荧光强度图显示为CN6的多重检测骨髓细胞癌基因MYC和β珠蛋白HBB的复孔分析黑色簇为阴性微滴绿色簇为MYC阳性微滴蓝色簇为HBB阳性微滴橙色簇为MYC和HBB均为阳性的微滴B，拷贝数图显示了从CN1到CN13样本精确的复孔数值QuantaSoft软件所生成的误差线表示95的置信区间NTC无模板对照Bio-RadLaboratories,Inc.ATAAAAACCCCCCCCCGGGGGGGGGGGGTTTTT2.Cancer/DNAMutationATAAAAACCCCCCCCCGGGGGGGGGGGGTTTTT2.Cancer/DNAMutationWHAT’SINADROPLET?Bio-Rad的ddPCR平台可以方便地与下一代测序NGS文库制备流程对接精确定量测序文库除了精确量化QX200系统所得到的结果包含测序文库的定性信息这是当前其他方法所不具备的这确保了文库上样量的一致性提高NGS的使用效率与成功率NGS运行结束后ddPCR还能对NGS的结果进行验证诸如单核苷酸多态性突变及拷贝数变异在内的基因组变异基因QX200系统的超高灵敏度特别适用于鉴定及定量稀有转录产物更好地了解RNA的功能QX200系统的高精确性可以用来检测倍比变化很小的基因表达深入了解基因的生理意义对RNA分子绝对定量的分析可深化现有的基因表达研究QX200ddPCR系统可以协助研究人员进行此类研究且无需设置标准曲线研究小组比较了ddPCR和其他方法定量Illumina公司TruSeq文库的结果使用ddPCR对5个不同浓度的文库进行了定量分析后研究人员的实验结果能够达到MiSeq平台所要求的进行NGS实验的最佳集群密度约为800000个mm2文库平行实验表明文库之间的差异小于1595的置信区间研究人员使用ddPCR研究野生型和突变型亨廷顿基因HTT编码的mRNA差异表达RNA转录水平差异的定量分析使研究人员更深入地了解细胞功能更好地了解疾病机制表达研究成功案例成功案例验证及文库定量NGSFormoreinformation,visit