2015-光学成像课件

显微光学成像生物磁共振分析重点实验室KeyLaboratoryofMagneticResonanceinBiologicalSystems武汉磁共振中心NationalCenterforMagneticResonanceinWuhan报告人：徐玲玲电话：[phone]E-mail：[e-mail]1•显微光学系统的基本理论•明场和微分干涉（DIC）显微成像•荧光显微成像•共聚焦、双光子激发荧光显微成像•荧光寿命显微成像•超分辨显微成像2提纲•显微光学系统的基本理论•明场和微分干涉（DIC）显微成像•荧光显微成像•共聚焦、双光子激发荧光显微成像•荧光寿命显微成像•超分辨显微成像3提纲人眼成像简单显微镜荷兰人安东尼·冯·列文虎克（AnthonyVonLeeuwenhoek，1632-1723）制造的显微镜。4显微镜的发展5复合显微镜的结构演变1600’s，詹森制造的是第一台复合式显微镜；1665年，RobertHooke第一个提出细胞概念，绘制了许多精美显微图像；1873年，ErnstAbbe发现光学显微镜的衍射极限；1886年，科勒（Kolher）照明充分发挥Abbe物镜的优势；19世纪末，分别出现金相显微镜、消像散物镜、双目显微镜和体视显微镜；1931年，ErnstRuska发明电子显微镜；1981年，Binig和Roher发明扫描隧道显微镜。显微镜的发展(a)DNAdoublehelix,about2nm;(b)Eight-cell-stagehumanembryothreedaysafterfertilization,about200μm;(c)Awolfspider,about15mmacross;(d)Emperorpenguins,about1mtall.人眼光学显微镜(75m)(200nm)超分辨显微镜(20nm)电镜(0.1nm)H.Lodishetal,MolecularCellBiology,5th,p196分辨率极限7显微镜的基本结构与部件光源聚光镜物镜目镜探测器•光源：白炽灯8显微镜的基本结构与部件卤素灯，是目前显微镜最常用的白炽灯光源之一，发射的是连续光。9•光源：弧光灯显微镜的基本结构与部件汞灯和氙灯较为常用。10显微镜的基本结构与部件•光源：激光荧光显微镜，共聚焦显微镜，双光子荧光显微镜，荧光寿命成像显微系统，都需要使用激光光源。分为：固体激光器，气体激光器，染料激光器，半导体激光器等11显微镜的基本结构与部件•聚光镜：使用数值孔径0.40以上的物镜时，必须具有聚光镜。种类：•阿贝聚光镜•消色差聚光镜•消球差聚光镜•消色差/消球差聚光镜作用：•将光聚焦于样品，得到最好的照明效果•弥补光量不足•适当改变光性质•是科勒照明的重要组成部分•物镜12显微镜的基本结构与部件显微镜最重要的光学部件对样品的第一次成像直接影响显微镜的成像质量和各项光学技术参数衡量一台显微镜质量的首要标准Achromatic：消色差Fluorite：萤石Apochromatic：复消色差13显微镜的基本结构与部件生产厂家Olympus：奥林巴斯Nikon：尼康Zeiss：蔡司Leica：徕卡物镜标示与光学参数14显微镜的基本结构与部件校正像差Plan：平场校正场曲，提高视场边缘成像质量Ach：消色差校正光轴上的位置色差（红和蓝光）、球差（黄绿光）和正弦差Apo：复消色差校正光轴上的位置色差（红和蓝）、球差（红和蓝光）和正弦差，以及二级光谱（校正绿光的位置色差）Fluor：萤石（半复消色差）成像质量介于消色差物镜和复消色差物镜之间15显微镜的基本结构与部件60x：放大倍数1.40：数值孔径浸法特征：Oil：油浸WI：水浸Gly：甘油MI：混合减小玻片和物镜成像介质间的折射率差异，提高数值孔径16显微镜的基本结构与部件特殊光学性质DIC：微分干涉衬式H：与专用Walloston棱镜配用达到最优放大D：暗视野式PH：相差式POL：偏振光式SF：无应变式M：金相（无盖玻片）17显微镜的基本结构与部件∞：筒长0.17：配用的盖玻片厚度（单位mm）WD0.21：工作距离（单位mm）盖玻片厚度不标准，光从盖玻片进入空气产生折射的光路发生改变，产生相差，即覆盖差盖玻片标准厚度为0.17mm，许可范围为0.16-0.18mm，物镜在制造上已将些厚度范围内的相关计算在内18显微镜的基本结构与部件工作距离与齐焦距离工作距离：样品正确聚焦时，物镜前透镜表面到样品之间的距离平常所说的调焦实际是调节工作距离物镜数值孔径越大，其工作距离越小齐焦：转换物镜时，样品均处于最佳焦面，且成像中心在一定范围内，即合轴齐焦距离：样品到物镜固定螺纹边缘之间的距离一般，齐焦距离设定为45mm，不同厂家制造的特殊物镜会有所区别19显微镜的基本结构与部件•相差物镜•微分干涉衬物镜•Hoffman调制相衬物镜•近红外显微镜用物镜•干涉显微镜用物镜•偏振光物镜•反射光物镜•数值孔径可调物镜•超低放大倍数物镜•长工作距离物镜特殊物镜种类相差物镜在物镜后焦面处加入涂有氟化镁的相板；延迟相位以区分直射光和衍射光，使光程差转换为振幅差。Hoffman调制相衬物镜提高未染色活体组织的可见度和对比度；在物镜的后焦面上装有独特的调制器—空间滤波器；将相位梯度转换为光强度变化，使透明的活体标本产生生动、具有三维立体感的图像。带校正环物镜调节配用的浸液；调节配用的载玻片厚度，校正覆盖差20显微镜的基本结构与部件•目镜SW：大视野UW：超大视野H：高焦点，允许观察者戴眼镜26.5：视场数（单位mm）视场直径=视场数/（物镜放大倍数×筒镜放大倍数）0.53mm=26.5mm/（40×1.25）作用：对物镜放大的实像（中间像）再放大视场：从显微镜目镜里看到的明亮的圆形范围21半孔径角样品与物镜间介质折射率•数值孔径（NumericalAperture，NA）:是判断物镜和聚光镜性能的重要技术参数。孔径角：光轴上物体点与物镜前透镜的有效直径所形成的角度Air=1Water=1.33Oil≈1.51增大孔径角——目前最大的能够做到76°增大数值孔径增大n值——使用水镜或油镜等为充分发挥物镜数值孔径，聚光镜的NA值应等于或略大于物镜的NA值显微镜的基本结构与部件22显微成像基本概念•横向分辨率Abbe定律：光学显微镜分辨率极限约为200nm分辨率公式取决于整个显微成像过程中各个光学部件参数，经过一系列理论推导得到，且与样品对比度和实际照明的效果有关减小波长——使用短波长光源提高分辨率增大NA值——使用高NA值的物镜增加明暗反差PracticalResolution(aswellasNA):abcddd23显微成像基本概念•纵向分辨率24分辨率除了与折射率，波长相关外，还与下面一些因素相关：对比度：足够的染色对比度或是光学对比度折射率差：镜头的分辨能力必须存在折射率差样品厚度：分辨率决不会高于样品厚度的~1/10分辨率的其他影响因素为了充分发挥显微镜的分辨能力，应使数值孔径与显微镜总放大倍率合理匹配。PlanAch20x0.4物镜10x光学放大PlanAch4x0.1物镜50x光学放大放大倍数=物镜放大倍数×目镜放大倍数显微成像基本概念25(1)防潮光学镜片就容易生霉、生雾。机械零件受潮后，容易生锈。(2)防尘光学元件表面落入灰尘，不仅影响光线通过，而且经光学系统放大后，会生成很大的污斑，影响观察。灰尘、砂粒落入机械部分，还会增加磨损，引起运动受阻，危害同样很大。注意保持显微镜的清洁。(3)防腐蚀显微镜不能和具有腐蚀性的化学试剂放在一起。如硫酸、盐酸、强碱等。(4)防热避免热胀冷缩引起镜片的开胶与脱落。使用后，要立即擦拭干净，用防尘透气罩罩好。注意：油镜使用后，一定要擦拭干净。用乙醚合液（酒精70%，乙醚30%）擦拭，擦洗镜头时，不能过用力，以防止损伤镀膜层。显微镜维护26•照明方式明场显微镜暗场显微镜•光学原理相差显微镜偏振（偏光）显微镜微分干涉衬显微镜（DIC）•成像原理或结构荧光显微镜共聚焦显微镜多光子显微镜显微镜分类•显微光学系统的基本理论•明场和微分干涉（DIC）显微成像•荧光显微成像•共聚焦、双光子激发荧光显微成像•荧光寿命显微成像•超分辨显微成像提纲2728透射式►光源的光通过样品后被物镜收集►适用于透明或半透明样品落射式►光源的光通过物镜再照射到样品►荧光显微镜中心式►光束的光轴与显微镜的光轴同线►绝大多数明场显微镜斜射式►光束的光轴与显微镜的光轴成一定角度►相差显微镜或暗场显微镜照明光束方向照明光束形成方式明场显微成像29透射/落射式明场照明明场显微成像30科勒照明科勒照明的优势：均匀而又充份明亮的照明不会产生耀眼的眩光不会烤焦样品极为有效的控制被照明的视场及其照明孔径要点：光源灯丝在聚光镜孔径光阑成像两组共轭平面明场显微成像-科勒照明310.810.540.18孔径光阑N.A.90%60%20%孔径光阑尺寸1.080.720.24与物镜N.A.比图像很亮，有很强的散射和炫目炫目感减弱，图像尖锐，没有明显的衍射细节衍射和反射而变模糊，分辨率下降例子：物镜:40x/0.75聚光镜:NA=0.90改变聚光镜孔径光阑的大小，使光源充满不同物镜的入射光瞳，而使聚光镜的数值孔径与物镜的数值孔径匹配。明场显微成像-孔径光阑32科勒照明的调节：调节视场光阑和聚光镜视场光阑和孔径光阑均关闭到最小调节聚光镜高度至六边形边缘尖锐调节聚光镜水平位置，使六边形位于视野正中打开视场光阑至整个视野被照明10x物镜明场显微成像33夹竹桃叶子哺乳动物肾脏手掌皮肤松针明场显微成像34微分干涉（DIC）显微成像微分干涉显微镜DifferentialInterferenceContrast(DIC)Microscopy：DIC显微镜使细胞的结构，特别是一些较大的细胞器，如核、线粒体等，立体感特别强，适合于显微操作。35微分干涉（DIC）显微成像1.科勒照明调节2.插入起偏器3.检查两棱镜是否已加入光路中4.插入检偏器，调节检偏器的角度，直至图像出现浮雕感。5.图像显示为一边明，一边暗。DIC调节简易步骤：36埋植于铜架中的铌-锡超导丝束(a)明场成像，黑色区域为制作过程中残留的锡，蓝色的一层为钽(b)暗场成像，超导丝和钽层没有成像，而残留的锡反射光成像，形成包围超导丝的金属环带(c)微分干涉衬成像，铜架清晰可见，但残留的锡和钽层却看不到不同成像方法相互补充微分干涉（DIC）显微成像37微分干涉（DIC）显微成像不同成像方法的比较：38•显微光学系统的基本理论•明场和微分干涉（DIC）显微成像•荧光显微成像•共聚焦、双光子激发荧光显微成像•荧光寿命显微成像•超分辨显微成像提纲39荧光显微镜为什么要使用荧光显微镜？如何快速找到感兴趣的区域或信息？40荧光标记感兴趣区域，可以快速获得感兴趣区域的有效信息。荧光显微镜41荧光：光照射到某些原子时，光的能量使原子核周围的一些电子由原来的轨道跃迁到了能量更高的轨道，即从基态跃迁到第一激发单线态或第二激发单线态等。第一激发单线态或第二激发单线态等是不稳定的，所以会恢复基态，当电子由第一激发单线态恢复到基态时，能量会以光的形式释放，所以产生荧光。荧光显微镜42（1）激发光谱：发光材料在不同波长光的激发下，该材料某一发光谱线与谱带的强度或发光效率与激发光波长的关系。（2）发射光谱：发光材料在某一激发光的激发下，其不同波长的发光强度的强弱变化。（3）荧光强度：荧光强度与该种物质的荧光量子产率、消光系数以及含量等因素有关。（4）荧光量子产率Q：量子产率表示物质将吸收的光能转化为荧光的本领，是荧光物质发出光子数与吸收光子数的比值。（5）荧光寿命：当一束光激发荧光物质时，荧光物质的分子吸收能量后从基态跃迁到某一激发态，再以辐射的形式发出荧光回到基态，激发停止时，分子的荧光强度降低到激发时最大强度的