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基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序•1.目的基因的获取•2.基因表达载体的构建•3.将目的基因导入受体细胞•4.目的基因的检测与鉴定知识点一：1.原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质.(以模板转录然后脱落)①不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质。能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质编码区非编码区原核细胞的基因结构②有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子终止子能够编码蛋白质的序列叫做外显子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子启动子终止子编码区上游编码区下游内含子：外显子：知识点一：2.真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点等。非编码序列：包括非编码区和内含子编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子启动子终止子编码区上游编码区下游原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非编码1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定知识点二.基因工程基本操作的四个步骤一、获取目的基因1.获取目的基因的途径A.从自然界已有的物种中分离B.人工合成2.获取目的基因的方法A.从基因文库中获取B.利用PCR技术扩增C.利用化学方法人工合成目的基因主要是______________________编码蛋白质的结构基因一、目的基因的获取（一）从基因文库中直接获取1.基因文库：概念见P92.基因文库的分类:按外源DNA片段的来源分类种类基因组DNA文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库3.基因文库的目的为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。4.获取目的基因的根据：见课本P9提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶切一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接导入受体菌中储存基因组文库5.基因文库的构建方法之一（1）直接分离法(鸟枪法)cDNA合成过程第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。5.基因文库的构建方法之基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制__________的核酸合成技术聚合酶链式反应体外特定DNA片段原理：DNA复制2、利用PCR技术扩增目的基因四种脱氧核苷酸(dNTP)一对引物：热稳定DNA聚合酶(Taq酶）模板DNA(需含有目的基因)Mg2+(激活剂)条件：缓冲溶液一对寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物前提：利用PCR技术扩增目的基因原理:DNA双链复制前提:要有一段已知目的基因的脱氧核苷酸序列，以便合成引物。过程高温变性（解旋为单链）低温退火（引物与单链互补结合）适温延伸（在Taq酶的作用下合成与模板互补的DNA双链）重复循环预变性（增加DNA变性的概率）2、具体过程PCR(多聚酶链式反应)目的基因的mRNA单链DNA(cDNA）双链DNA(即目的基因)反转录合成1）反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列目的基因推测推测化学合成2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法：3、人工合成的目的基因二、基因表达载体的构建——基因工程的核心1、目的：所需物质：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。2、基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。注意三、将目的基因导入受体细胞---植物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力将目的基因导入受体细胞---动物细胞显微注射法将目的基因导入受体细胞---微生物细胞Ca2+处理使细胞处于一种能吸收周围环境中的DNA---感受态细胞四、目的基因的检测与鉴定检测:是否插入目的基因（DNA分子杂交技术）是否转录（mRNA分子杂交技术）是否翻译（抗原—抗体杂交技术）鉴定:功能活性鉴定抗性鉴定分别提取什么进行检测归纳步骤DNA分子杂交示意图采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。归纳:基因工程的基本操作程序1.获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成2.构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因3.将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、显微注射法4.目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译基因操作的基本步骤基因操作的基本步骤