细胞工程与作物育种

第十三章细胞工程与作物育种克隆羊的产生克隆羊多莉克隆猪克隆羊植物细胞工程：以植物组织和细胞培养技术为基础发展起来的一门学科。它以细胞为基本单位，在体外条件下进行培养、繁殖或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿生产某种物质的过程。包括:花药培养、体细胞变异筛选、幼胚培养、原生质体融合等植物组织和细胞培养：是指在人工控制下，把植物体的一个器官、一种组织或单个细胞从植物体分离后置育适当的营养和环境条件下，使之继续生长、分化并发育成完整的再生植株的培养技术。细胞全能性：是指细胞所具有的形成各种细胞类型的潜在能力。即每个体细胞象胚胎细胞一样，可以经过体外培养成为一个完整的植株的能力。1904年，Hanning用萝卜胚培养，获得小植株；1934年，White对番茄根尖切段进行培养，建立了无性繁殖系；1958年，Stewart等从胡萝卜根的悬浮细胞诱导分化成完整小植株。1964年，Guha从曼陀罗花药培养出单倍体植株；1971年，Takebe等首次从烟草原生质体获得再生植株。发展第一节植物细胞和组织培养技术一、培养基及其组成（一）培养基的种类和特点常用的培养基:MS、White、N6、B5等。MS培养基的无机盐和离子浓度较高，养分平均；White培养基无机盐含量较低，适于生根培养；N6培养基成分较简单、KNO3、（NH4）SO4含量高，是花药培养常用的培养基。（二）培养基的成分培养基中应包括植物生长必需的16种营养元素和生理活性物质；包括三类：无机营养物、有机物和植物生长调节物质。植物组织培养中最主要的两种生长调节物质是：生长素和细胞分裂素。水有机物大量元素微量元素糖(碳源和能源)氨基酸（有机氮源）维生素生长素细胞分裂素赤霉素脱落酸乙烯NPKCaMgSFeCoZnNiBAlMnMoCuI酵母提取物椰子汁水解洛蛋白蛋白胨植物组织培养所需的养分和激素生长调节物质成分不定物质生长素作用:诱导愈伤组织的形成，胚状体的产生以及试管苗的生根，更重要的是配合一定比例的细胞分裂素诱导腋芽及不定芽的产生。生长素包括：2，4—三氯苯氧乙酸(2，4—D)、萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)、吲哚乙酸(IAA)。作用的强弱顺序:为2，4-D萘乙酸≥吲哚丁酸吲哚乙酸。细胞分裂素作用：有促进细胞分裂和分化、延迟组织衰老、增强蛋白质合成、抑制顶端优势、促进侧芽生长及显著地改变其他激素作用的特点。细胞分裂素包括：激动素(KT)、6—苄基氨基嘌呤(6－BA)、玉米素(ZT)等。作用的强弱顺序:为玉米素6—苄基氨基嘌呤激动素。二、培养基的配制（一）母液的配制母液：高浓度的储备液。按大量元素、微量元素、铁盐、有机物分别单独配制成母液。激素：每种激素单独配制母液，浓度一般为0.1、0.5、1.0mg/ml。IAA、IBA先溶于少量95％酒精，再加水定容；2，4－D用1mol的NaOH溶解后再定容；KT和BA先溶于少量1molHCl，然后定容。（二）培养基的配制步骤：混合各成分母液；加糖和母液混合至所需浓度，补水至所需量；调节PH；加入琼脂加热至琼脂完全熔化；分装；高压灭菌。三、无菌操作方法（一）消毒剂常用消毒剂：0.1%的升汞、70％酒精和次氯酸钠。（二）无菌操作（三）无菌培养四、植物组织和细胞培养方法（一）概念脱分化：一个已停止分裂的成熟细胞转变为分生状态并形成未分化的愈伤组织的现象叫脱分化。组织培养中，利用特定的条件，使原已分化并具有一定功能的植物细胞脱离原有轨道，失去原有状态和功能而回复到能分裂和增殖的愈伤组织状态，就是脱分化过程。再分化：把原已分化的细胞，经脱分化培养后再次进行的分化现象叫再分化。植株的再生：产生分生组织，继而进行形态建成，最终分化出器官，产生完整植株，称植株的再生。外植体：用于进行植物组织培养的各种植物材料。包括叶、茎、根、幼胚、幼穗等。组织培养过程：脱分化再分化生长/发生外植体愈伤组织生长点根、茎、叶或胚状体小植株（二）组织培养的五个阶段：预备阶段；诱导（脱分化）阶段；继代增殖阶段；生根成芽阶段；移栽成活阶段。愈伤组织第二节细胞和组织培养与作物育种一、体细胞克隆变异及其育种利用体细胞克隆（无性系）变异：是指植物组织和细胞培养物在培养过程中产生的变异。变异类型：形态性状变异；育性变异；抗性变异；产量和品质变异等。1、染色体数目变异：二倍体变异频率随培养时间延长二降低，四倍体变异则相反。2、染色体结构变异：最主要的是染色体缺失、倒位、重复和易位。3、点突变：自发突变：诱发突变；基因的表达及基因放大和衰减;（一）体细胞克隆变异的遗传基础（二）突变体的筛选筛选剂的确定；筛选剂浓度：利用悬浮培养，找出半致死剂量和致死剂量；一般选择近于杀死全部细胞的剂量进行突变体筛选；筛选方法：一步筛选法和多步筛选法；筛选材料：原生质体、愈伤块、悬浮培养物、花粉或小孢子培养物等。（三）在作物改良中的应用抗病：如利用病菌毒素作为筛选剂进行抗病突变体筛选；抗除草剂：耐盐：以NaCl或海水为选择剂，对细胞或诱变细胞进行筛选；耐旱：优良品种细胞培养R0R1群体改良的体细胞克隆遗传稳定性测试育成新品系区域试验审定投入生产田间试验多点田间试验继续田间试验,种子富集互交测试确定遗传方式利用体细胞克隆变异育种的技术路线二、单倍体细胞培养及育种利用（一）单倍体培养在育种中的应用后代快速纯合；提高选择效率；排除杂种优势对后代选择的干扰；遗传研究的良好实验材料体系；突变体的筛选。小麦离体培养（二）单倍体细胞培养与植物育种花培育种技术：以小麦为例取样：选取合适的花药；前处理:4℃处理4-5天；接种花药：接种后28℃处理3天，25℃处理20－30天（诱导培养基）；愈伤组织：继代培养；出芽和生根：分化培养基进行出芽和生根培养；移苗：4℃处理30天左右；练苗：打开瓶口，练苗7－8天；移栽：将苗移栽入花盆。（三）影响花药培养的因素供体植物的基因型；供体植物的生长条件：供体植株的年龄；花粉发育时期：如禾本科在单核早期；花蕾和花药的预处理；如大麦4℃处理28天效果较好。培养基：如MS、N6在禾谷类作物中较多使用；培养条件：如温度、光照。单倍体细胞培养及育种技术A品种单倍体培养B品种F1杂种重组纯合系重组了A和B品种优点的纯系遗传稳定性测定推广利用新品系花药培养染色体加倍选择田间试验田间试验品种×（四）单倍体诱导中存在的问题产生单倍体的同时也产生二倍体或多倍体；白化苗难以避免；产生褐化；诱导频率偏低。白化苗三、幼胚培养与远缘杂交1、植物胚胎培养：使胚及具有胚器官（如子房）在离体无菌条件下发育成幼苗的技术。2、胚胎培养的作用：克服远缘杂种胚的早期败育现象；提高远缘杂种的成苗率；使种子无生活力的植株获得后代；使胚发育不全的植株获得后代；克服种子休眠，提早结实，缩短育种周期。四、种质的长期保存五、植物脱毒：无性繁殖作物，受到病毒等的侵染，一般顶端分生组织不带毒或带毒很低，利用茎尖培养的方法使植物脱毒。六、植物的快速繁殖：主要通过诱导茎芽形成实现。七、人工种子